Tandhjulsgear Organization of Blood koagulationsfaktor VIII på Lipid Nanorør
Summary
Vi præsenterer en kombination af Cryo-elektronmikroskopi, lipid nanoteknologi og struktur analyse anvendes for at løse den membranbundne struktur med to meget homologe FVIII former: menneskelige og svin. Den metode, udviklet i vores laboratorium for at skruelinieform organisere de to funktionelle rekombinante FVIII formularer på negativt ladede lipid-nanorør (LNT) er beskrevet.
Abstract
Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) 1 er en kraftfuld metode til at undersøge den funktionelle struktur af proteiner og komplekser i en hydratiseret tilstand, og membranen miljø 2.
Koagulationsfaktor VIII (FVIII) 3 er et multi-domæne blodplasma glycoprotein. Defekt eller mangel på FVIII er årsagen til hæmofili type A – en alvorlig blødersygdom. Ved proteolytisk aktivering FVIII binder til serinprotease faktor IXa på negativt ladede blodplademembranen, hvilket er kritisk for normal blodpropper 4. På trods af den centrale rolle FVIII spiller i koagulation, strukturel information for sin membran-bundne tilstand er ufuldstændig 5. Rekombinant FVIII-koncentrat er den mest effektive lægemiddel mod hæmofili type A og kommercielt tilgængelig FVIII kan udtrykkes som human eller porcin begge danner funktionelle komplekser med human faktor IXa 6,7.
"> I denne undersøgelse præsenterer vi en kombination af Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), lipid nanoteknologi og struktur-analyse anvendes for at løse den membranbundne struktur med to meget homologe FVIII former:. Human og porcin Den metode udviklet i vores laboratorium at spiralformet organisere to funktionelle rekombinante FVIII formularer på negativt ladede lipid nanorør (LNT) er beskrevet. De repræsentative resultater viser, at vores fremgangsmåde er tilstrækkelig følsom til at definere forskellene i den spiralformede organisation mellem de to meget homologe i sekvens (86% sekvensidentitet ) proteiner. Detaljerede protokoller for de spiralformede organisation, Cryo-EM og elektron tomografi (ET) dataopsamling er givet. De to-dimensionelle (2D) og tre-dimensionelle (3D) struktur analyse anvendes til at opnå 3D rekonstruktioner af menneskelige og svin FVIII-LNT diskuteres. De præsenterede menneskelige og svin FVIII-LNT strukturer viser potentialet i den foreslåede metode til berege funktionelle, membranbundet organisering af blodkoagulationsfaktor VIII med høj opløsning.Introduction
Blodkoagulationsfaktor VIII (FVIII) er et stort glycoprotein 2.332 aminosyrer organiseret i seks områder: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Ved trombinaktivering FVIII fungerer som cofaktor for faktor IXa under den membranbundne tenasekompleks. Binding af aktiverede FVIII (FVIIIa) til FIXa i en membran-afhængig måde forbedrer FIXa proteolytiske effektivitet mere end 10 5 gange, hvilket er afgørende for en effektiv blodets koagulation 4. På trods af den vigtige rolle, FVIII spiller i koagulation og tenasekompleks formationen, funktionel membranbundet FVIII struktur er endnu ikke løst.
For at løse dette, enkeltdoser lipiddobbeltlaget nanorør (LNT) rig på phosphatidylserin (PS), der er i stand til at binde FVIII med høj affinitet 8, 9 og ligner den aktiverede blodpladeoverfladen blevet udviklet 10. Fortløbende spiralformet organisering af FVIII bundet til LNT har vist sig at være effective for struktur bestemmelse af FVIII membranbundne tilstand af Cryo-EM 5.. Funktionaliserede LNT er et ideelt system til at studere protein-protein-og protein-membran interaktioner af spiralformet arrangeret membran-associerede proteiner Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM har den fordel i forhold til traditionelle strukturelle metoder såsom røntgenkrystallografi og NMR, som prøven er bevaret på tættest på det fysiologiske miljø (puffer, membran, pH), uden tilsætningsstoffer og isotoper. I tilfælde af FVIII, studerer den membranbundne struktur med denne teknik er endnu mere fysiologisk relevant, da LNT ligner nøje af størrelse, form og sammensætning pseudopodia af de aktiverede blodplader, hvor TENase komplekser samles in vivo.
Mangler og mangel på FVIII årsag Hæmofili A, en alvorlig blødning lidelse, der rammer 1 ud af 5.000 hanner af den menneskelige befolkning 4, 6. Den mest eFFEKTIV terapi for Hæmofili A er livslang administration af rekombinant humant FVIII (hFVIII). En væsentlig komplikation af den rekombinante FVIII Hæmofili A-behandling er udviklingen af inhiberende antistoffer til den menneskelige form påvirker cirka 30% af hæmofili A-patienter 13. I dette tilfælde er porcin FVIII (pFVIII) koncentrat anvendes som svin FVIII viser lav krydsreaktivitet med inhiberende antistoffer mod human faktor VIII og danner funktionelle komplekser med human FIXa 7. Er vigtigt Etablering den membranbundne organisering af både porcin og human FVIII former til at forstå det strukturelle grundlag FVIII cofaktor funktion og konsekvenser for blod hæmostase.
I denne undersøgelse beskriver vi en kombination af lipid nanoteknologi, Cryo-EM, og struktur-analyse, der skal løse den membranbundne tilrettelæggelsen af to meget homologe FVIII former. De præsenterede Cryo-EM data og 3D-strukturer for skruelinieform organiseret porcine og menneskelig FVIII på negativt ladede LNT viser potentialet i den foreslåede nanoteknologi som grundlag for strukturen bestemmelse af FVIII og membranbundne koagulationsfaktorer og komplekser i en fysiologisk membran miljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde en metode præsenteres at differentiere mellem to membranbundne organisationer af meget homologe proteiner: human og porcin FVIII selvstændig samlet på lipidnanorør i de betingelser, der er stødt på i den menneskelige krop.
I den beskrevne procedure, er mennesker og svin FVIII organiseret succes i spiralform på lipidnanorør, som er det mest afgørende skridt. Den næste kritiske trin er at bevare prøven i tynd amorf is ved flash frysning p?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er støttet af et nationalt Scientist Development tilskud fra American Heart Association: 10SDG3500034 og UTMB-NCB opstart midler til SSM. Forfatterne anerkender Cryo-EM og Scientific Computing faciliteter på Sealy Center for Strukturel Biologi ved UTMB ( www.scsb.utmb.edu ), samt Drs. Steve Ludtke og Ed Egelman for hjælp med 2D og 3D spiralformede genopbygning algoritmer.
Materials
| JEM2100 with LaB6 | JEOL Ltd. | JEM-2100 | operated at 200 kV |
| with TEMCON software | JEOL Ltd. | ||
| Gatan626 Cryo-holder | Gatan, Inc. | 626.DH | cooled to -175 °C |
| with temperature controler unit | Gatan, Inc. | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Inc. | US4000 | 4096 x 4096 pixel at 15 microns/pixel physical resolution |
| Solarus Model 950 plasma cleaner | Gatan, Inc. | ||
| Vitrobot Mark IV | FEI | ||
| Materials | |||
| Carbon coated 300 mesh 3mm copper grid | Ted Pella | 01821 | plasma cleaned for 10 s on high power |
| Quantifoil R2/2 300 mesh | Electron Microscopy Sciences | Q225-CR2 | Carbon coated 300 mesh Cu grids with 2 mm in diameters holes |
| Uranyl acetate dihydrate | Ted Pella | 19481 | 1% solution, filtered |
| Galactosyl ceramide | Avanti Polar Lipids Inc. | 860546 | |
| Dioleoyl-sn-glycero-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids Inc. | 840035 | |
| Software | |||
| EM software Digital Micrograph | Gatan, Inc. | http://www.gatan.com/DM/ | |
| EM software EMAN | free download | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ | |
| EM software Spider | free download | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| EM software IHRSR | free download | Programs available from Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | |
| EM software (IMOD) | free download | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| EM software (SerialEM) | free download | ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/ | |
| UCSF-Chimera | free download | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html |
References
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 37, 3-13 (2004).
- Fujiyoshi, Y., Unwin, N. Electron crystallography of proteins in membranes. Current opinion in structural biology. 18, 587-592 (2008).
- Toole, J. J., et al. Molecular cloning of a cDNA encoding human antihaemophilic factor. Nature. 312, 342-347 (1984).
- Fay, P. J. Factor VIII structure and function. International journal of hematology. 83, 103-108 (2006).
- Stoilova-McPhie, S., Lynch, G. C., Ludtke, S. J., Pettitt, B. M. Domain organization of membrane-bound factor VIII. Biopolymers. , (2013).
- Pipe, S. W. Hemophilia: new protein therapeutics. Hematology / the Education Program of the American Society of Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2010, 203-209 (2010).
- Gatti, L., Mannucci, P. M. Use of porcine factor VIII in the management of seventeen patients with factor VIII antibodies. Thrombosis and haemostasis. 51, 379-384 (1984).
- Parmenter, C. D., Cane, M. C., Zhang, R., Stoilova-McPhie, S. Cryo-electron microscopy of coagulation Factor VIII bound to lipid nanotubes. Biochemical and biophysical research communications. 366, 288-293 (2008).
- Parmenter, C. D., Stoilova-McPhie, S. Binding of recombinant human coagulation factor VIII to lipid nanotubes. FEBS letters. 582, 1657-1660 (2008).
- Wassermann, G. E., Olivera-Severo, D., Uberti, A. F., Carlini, C. R. Helicobacter pylori urease activates blood platelets through a lipoxygenase-mediated pathway. Journal of cellular and molecular medicine. 14, 2025-2034 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Chappie, J. S., Arthur, C. P. Helical crystallization of soluble and membrane binding proteins. Methods in enzymology. 481, 45-62 (2010).
- Egelman, E. H. Reconstruction of helical filaments and tubes. Methods in enzymology. 482, 167-183 (2010).
- Lusher, J. M. Development and introduction of recombinant factor VIII–a clinician’s experience. Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 18, 483-486 (2012).
- Thim, L., et al. Purification and characterization of a new recombinant factor VIII (N8). Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia. 16, 349-359 (2010).
- Doering, C. B., Healey, J. F., Parker, E. T., Barrow, R. T., Lollar, P. High level expression of recombinant porcine coagulation factor VIII. The Journal of biological chemistry. 277, 38345-38349 (2002).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of structural biology. 157, 38-46 (2007).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85, 225-234 (2000).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. Journal of structural biology. 157, 83-94 (2007).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
- Stoilova-McPhie, S., Villoutreix, B. O., Mertens, K., Kemball-Cook, G., Holzenburg, A. 3-Dimensional structure of membrane-bound coagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography. Blood. 99, 1215-1223 (2002).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157, 281-287 (2007).
