בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק
Summary
השן החותכת העכבר הולך ומתרחבת מספקת מודל ללימוד חידוש רקמות שיניים מתאי גזע שיניים אפיתל (DESCs). מערכת חזקה בעקביות ובאמינות קבלת תאים אלה מהשן החותכת והרחבתן במבחנה הוא דיווח כאן.
Abstract
הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס התחדשות שן וחידוש הפכה לנושא עניין רב 1-4, והשן החותכת העכבר מספקת מודל לתהליכים אלה. איבר מופלא זה גדל ברציפות לאורך כל חייו של בעל החיים ומייצר את כל סוגי התאים הדרושים מבריכות פעילה של תאי גזע בוגרים שוכנו בשפתני (לכיוון השפתיים) והלשוני (לכיוון הלשון) לולאת צוואר הרחם אזורים (CL). רק תאי גזע שיניים מCL שפתני להצמיח ameloblasts שיוצרים אמייל, כיסוי החיצוני של שיניים, על פני השטח שפתני. היווצרות אמייל סימטרית זה מאפשרת שחיקה בקצה השן החותכת, ואת האבות ותאי גזע בשן החותכת הפרוקסימלי להבטיח כי רקמות השיניים מתחדשת כל הזמן. היכולת לבודד ולגדל תאי גזע או אלה במבחנה מאפשרת הרחבה שלהם ופותחת דלתות למספר רבים של ניסויים לא השגה in vivo, כגון שעותבדיקת תפוקת igh של גורמי רגולציה בתאי גזע פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים ומדגימים שיטה אמינה ועקבית לתאי תרבות מCL שפתני של השן החותכת העכבר.
Introduction
אחד המאפיינים הייחודיים של בעלי חוליות היא האבולוציה של שיניים. השן הפכה מערכת מודל חשובה לתחומים רבים של מחקר, כמו המסלולים המולקולריים ומורפולוגיים התמחויות רלוונטיות לאיבר זה נחקרו מכמה נקודות מבט, ובכלל זה על ידי ביולוגים התפתחותיים והאבולוציונית 5. לאחרונה, תחום של רפואת רגנרטיבית החל לצבור תובנות רבות ערך באמצעות שן כמודל. בפרט, את הגילוי של תאי גזע אפיתל שיניים כבר מקדמה חשובה 6-13.
כל המכרסמים יש שיניים חותכות הולכות ומתרחבות צמיחה שמונעת על ידי תאי גזע, מה שהופך את השיניים האלה מערכת מודל נגישה ללמוד ויסות תאי גזע בוגרים. ניסויי תיוג ב1970s 10,11, ואחרי ניסויי התחקות שושלת גנטית 8,9,12,14, הוכיחו כי DESCs מתגורר באזור הפרוקסימלי של השן החותכת. הגזעצאצאי תא בתא אפיתל בצד המהלך שפתני מהנישה המשוערת, המכונה לולאת שפתני צוואר הרחם (CL), ולתרום לאוכלוסייה של תאים הנקראת תאים (ת"א) הגברת מעבר (איור 1). באופן ספציפי, DESCs מתגורר באפיתל החיצוני האמייל (OEE) וreticulum stellate (SR) 8,9,14, ואפיתל האמייל הפנימי (IEE) מעורר את תאי ת"א שיתקדמו במספר מוגבל של מחזורי תא ולאחר מכן מהלך distally לאורכו של השן החותכת (איור 1). Ameloblasts ההבחנה בשן החותכת העכבר ימשיך לנוע distally לאורך השן החותכת בקצב מדהים של כ 350 מיקרומטר ביום אחד 15,16. כאשר הם עוברים, התאים להתמיין ameloblasts הבוגר וintermedium שכבת תאים (SI). לאחר ההפקדה בעובי המלא של מטריצת אמייל, רבים של ameloblasts עובר אפופטוזיס, והתאים שנותרו להתכווץ בגודל ולהסדיר התבגרות אמייל <sup> 17. השושלת של סוגי תאים האחרים בCL שפתני, כגון SR, היא פחות ברורה, ונתונים לגבי תאי הגזע בmesenchyme 18 ובCL הלשוני רק מתחילים לצוץ.
שימוש במודל חותך העכבר, מספר הקבוצות עבד על מנת להבהיר את המסלולים הגנטיים ותהליכים ביולוגיים תא מעורב בחידוש איברים טבעי גזע מבוסס תאים. עם זאת, CL שפתני מכיל מספר קטן יחסית של תאים, מוערך בכ -5,000 לשן חותכת עכבר, מה שהופך את העבודה עם תאים ראשוניים מאתגרים. לכן, נעשו מאמצים לתרבות ולהרחיב את התאים האלה במבחנה 6,16,19,20 על מנת לפתוח דלתות חדשות לגישות ניסיוניות שאינן ברי השגה in vivo. המחקר שנערך לאחרונה רוב הוכיח כי תאים אלה יכולים גם עצמי לחדש ולהתמיין לamelogenin לבטא בתאים כאשר 13 בתרבית. כאן, אנו מתארים ומדגימים שיטה להדואר תרבות אמינה ועקבית של תאים משפתני העכבר CL.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי אפיתל היו ראשון בהצלחה בתרבית לפני למעלה 40 שנות 21-24, ולאחרונה, בידוד מוצלח של תאי גזע אפיתל 25-27 יש הידע מתקדם של ביולוגיה האפיתל שלנו. אנו מדווחים על פרוטוקול לבידוד DESCs של השן החותכת העכבר המבוגר, אוכלוסייה יחסית understudied של תאי גזע שיש לו הפוטנציאל להניב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים Xiu-פינג וואנג לעזרה ראשונית עם תרבויות DESC. המחברים ממומנים בחלקו על ידי מלגות ומענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (K99-DE022059 לAHJ, K12-GM081266 לMGC, K08-DE022377-02 לאה, וR01-DE021420 לODK).
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
References
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
