Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l'adulte de souris Incisive

Summary

L'incisive de la souris en croissance continue fournit un modèle pour l'étude de renouvellement des tissus dentaires à partir de cellules souches épithéliales dentaires (DESCs). Un système solide de façon cohérente et fiable obtention de ces cellules de l'incisive et leur expansion in vitro est rapporté ici.

Abstract

Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la régénération de la dent et le renouvellement est devenu un sujet de grand intérêt ^1-4, et l'incisive de la souris fournit un modèle pour ces processus. Cet organe remarquable pousse en permanence tout au long de la vie de l'animal et génère tous les types de cellules nécessaires de piscines actives de cellules souches adultes logés dans le labiale (vers la lèvre) et multilingue (vers la langue) boucle col de l'utérus (CL) des régions. Seules les cellules souches de l'art dentaire labiale CL donnent lieu à adamantoblastes qui génèrent émail, l'enveloppe externe de dents, à la surface labiale. Cette formation de l'émail asymétrique permet à l'abrasion, à la pointe de l'incisive, et les progéniteurs et les cellules souches dans le incisive proximale veiller à ce que les tissus dentaires sont constamment renouvelés. La capacité d'isoler et de cultiver ces cellules progénitrices ou souches in vitro permet leur expansion et ouvre les portes à de nombreuses expériences pas réalisables in vivo, comme htests de débit aute de facteurs de régulation de cellules souches potentiel. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode fiable et cohérente à des cellules de culture de la CL vestibulaire de l'incisive de la souris.

Introduction

L'une des caractéristiques uniques de vertébrés est l'évolution de dents. La dent est devenue un important système modèle pour de nombreux domaines de recherche, comme les voies moléculaires et morphologiques spécialisations pertinentes à cet organe ont été étudiés à partir de plusieurs points de vue, y compris par les biologistes du développement et de l'évolution ^5. Plus récemment, le domaine de la médecine régénérative a commencé à acquérir de précieuses connaissances en utilisant la dent comme un modèle. En particulier, la découverte de cellules souches épithéliales dentaires a été un progrès important ^6-13.

Tous les rongeurs possèdent incisives croissance continue dont la croissance est alimentée par les cellules souches, faisant de ces dents d'un système de modèle accessible pour étudier la régulation des cellules souches adultes. expériences en matière d'étiquetage dans les années 1970 ^10,11, suivie par la lignée génétique des expériences de traçage ^8,9,12,14, ont démontré que DESCs résident dans la région proximale de l'incisive. La tigedescendance des cellules épithéliales dans le compartiment sur ​​le côté labial de déplacement hors de la niche putatif, connu sous le col de l'utérus boucle labial (CL), et de contribuer à une population de cellules appelées transit d'amplification (AT) des cellules (figure 1). Plus précisément, DESCs résident dans l'épithélium externe de l'émail (OEE) et réticulum étoilé (SR) ^8,9,14, et l'épithélium adamantin interne (EEI) donne lieu à des cellules d'assistance technique qui progressent à travers un nombre limité de cycles cellulaires et mouvement de manière distale le long de la longueur de l'incisive (Figure 1). Les améloblastes de différenciation dans l'incisive de la souris continuent à se déplacer le long de distale de l'incisive à un taux remarquable d'environ 350 um en une seule journée ^15,16. Comme ils se déplacent, les cellules se différencient en améloblastes matures et strate intermedium (SI) des cellules. Après le dépôt de la totalité de l'épaisseur de la matrice de l'émail, bon nombre des adamantoblastes subissent une apoptose, et les cellules restantes diminuer en taille et réguler la maturation émail <sup> 17. La lignée des autres types de cellules dans le CL labial, tels que le SR, est moins claire, et les données concernant les cellules souches dans le mésenchyme ¹⁸ et dans la face linguale CL commencent seulement à émerger.

En utilisant le modèle de l'incisive de la souris, un certain nombre de groupes ont travaillé à élucider les voies génétiques et les processus biologiques cellulaires impliqués dans le renouvellement des organes à base de cellules souches naturel. Cependant, la labiale CL contient un nombre relativement restreint de cellules, estimée à environ 5.000 par incisive de la souris, ce qui permet de travailler avec des cellules primaires contester. Par conséquent, des efforts ont été faits pour la culture et d'élargir ces cellules in vitro ^6,16,19,20 afin d'ouvrir de nouvelles portes à des approches expérimentales qui ne sont pas réalisables in vivo. L'étude la plus récente a démontré que ces cellules peuvent à la fois se renouveler et de se différencier en cellules exprimant amelogenin lorsqu'elles sont cultivées ^13. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode pour ee culture fiable et cohérente des cellules de la labiale de la souris CL.

Protocol

1. Disséquer Basse Hemi-mandibules de souris adulte Avant d'effectuer ce protocole, obtenir l'approbation institutionnel nécessaire et assurez-vous de respecter toutes les directives de protection des animaux. Euthanasier des animaux en utilisant la norme IACUC procédures approuvées. Pour ce travail asphyxie au CO2 a été utilisée, suivie par dislocation cervicale. OPTION: tête séparée du reste du corps en utilisant une lame de rasoir. Retirez la peau d…

Representative Results

L'hémi-mandibule de la souris un comprend croissance continue incisive et trois molaires enracinées (figure 1A). Toutes les dents sont constituées de la dentine et de l'émail, les deux composants minéralisées de la couronne de la dent (Figures 1A et 1A '). Les maisons des incisives deux niches de cellules souches appelées CL labiale et linguale CL, et l'émail est formé exclusivement sur ​​le côté labial (figure 1A). DESCs …

Discussion

Les cellules épithéliales ont d'abord été cultivées avec succès il ya 40 ans ^21-24 et, plus récemment, réussi à isoler des cellules souches épithéliales ^25-27 a fait progresser notre connaissance de la biologie épithéliale. Nous rapportons un protocole pour isoler le DESCs de l'incisive de souris adulte, une population relativement peu étudié des cellules souches qui a le potentiel pour obtenir des informations importantes sur la biologie dentaire et la formation de l'ém…

Materials

Forceps, size 5	Fine Science Tools	11251-30	FST by Dumont, Dumoxel,
Forceps Straight, fine, 3.5	Roboz	RS5070
Razorblades	Electron Microscopy Services	#71960
Scalpel Handle No.3	VWR
Feather Blade No. 15	Electron Microscopy Services	#72044-15	Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered	Worthington Biochemical Corporation	#4214
Insulin syringe	BD	#329424
Accumax	EMD Millipore	#SCR006
DMEM/F12	Gibco	11320-033
EGF	R&D	2028-EG-200
FGF2	R&D	233-FB-025
B27 Supplement	Gibco	10889-038