العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة
Summary
يوفر القاطعة الماوس تزايد مستمر نموذجا لدراسة تجديد أنسجة الأسنان من الخلايا الجذعية الظهارية الأسنان (DESCs). وتفيد التقارير ان نظام قوي للباستمرار وبشكل موثوق الحصول على هذه الخلايا من القاطعة وتوسيعها في المختبر هنا.
Abstract
فهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء تجديد الأسنان والتجديد أصبح موضوع اهتمام كبير 1-4، ويوفر الماوس القاطعة نموذجا لهذه العمليات. هذا الجهاز الرائع تنمو باستمرار طوال حياة الحيوان ويولد كل أنواع الخلايا اللازمة من أحواض نشطة من الخلايا الجذعية البالغة يضم في الشفة (الشفة نحو) واللغات (نحو اللسان) حلقة عنق الرحم (CL) المناطق. فقط الخلايا الجذعية الأسنان من CL شفوي تؤدي إلى خلايا تكوين المينا التي تولد المينا، والغطاء الخارجي للأسنان، على سطح شفوي. هذا التشكيل المينا غير المتماثلة يسمح التآكل في الطرف القاطعة، والأسلاف والخلايا الجذعية في القاطعة الداني ضمان أن أنسجة الأسنان تتجدد باستمرار. القدرة على عزل وزراعة هذه الخلايا الاصلية أو الجذعية في المختبر يسمح توسعها وتفتح الأبواب أمام العديد من التجارب لا يمكن تحقيقه في الجسم الحي، مثل حIGH اختبار الإنتاجية من العوامل التنظيمية الخلايا الجذعية المحتملة. هنا، نحن تصف ويبرهن على وجود طريقة موثوقة ومتسقة لخلايا الثقافة من CL شفوي من القاطعة الماوس.
Introduction
واحدة من الخصائص الفريدة من الفقاريات هو تطور الأسنان. أصبح الأسنان نظام نموذجا هاما للمناطق عديدة من البحث، حيث تم التحقيق في المسارات الجزيئية والمورفولوجية التخصصات ذات الصلة لهذا الجهاز من عدة زوايا، بما في ذلك علماء البيولوجيا التطورية والتطورية 5. وفي الآونة الأخيرة، بدأ مجال الطب التجديدي للحصول على معلومات قيمة باستخدام الأسنان كنموذج. على وجه الخصوص، وقد تم اكتشاف الخلايا الجذعية الظهارية الأسنان تقدما هاما 6-13.
جميع القوارض تمتلك القواطع تزايد مستمر الذي يغذيه نمو الخلايا الجذعية، مما يجعل هذه الأسنان نظام نموذج الوصول إليها لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للبالغين. ، وقد أثبتت التجارب وضع العلامات في 1970s 10،11، تليها النسب الوراثية التجارب التي تتبع 8،9،12،14 DESCs يقيمون في المنطقة القريبة من القاطعة. جذعذرية خلية في مقصورة الظهارية على هذه الخطوة الجانب شفوي من مكانة المفترضة، والمعروفة باسم حلقة عنق الرحم شفوي (CL)، والمساهمة في السكان من الخلايا تسمى (TA) العبور تضخيم الخلايا (الشكل 1). على وجه التحديد، DESCs يقيمون في ظهارة الخارجي المينا (OEE) وشبكية النجمية (SR) 8،9،14، والمينا ظهارة الداخلية (IEE) يثير الخلايا TA التي تقدم من خلال عدد محدود من دورات الخلية ثم الخطوة بشكل أقصى طول طول القاطعة (الشكل 1). تواصل خلايا تكوين المينا التفريق في القاطعة الماوس للتحرك بشكل أقصى طول القاطعة بمعدل ملحوظ من حوالي 350 ميكرومتر في يوم واحد 15،16. لأنها تتحرك، فإن الخلايا تتمايز إلى خلايا تكوين المينا ناضجة والطبقة intermedium (SI) الخلايا. بعد إيداع كامل سماكة المينا المصفوفة، فإن العديد من خلايا تكوين المينا الخضوع لموت الخلايا المبرمج، والخلايا المتبقية في تقليص حجم وتنظيم نضوج المينا <سوب> 17. سلالة من أنواع الخلايا الأخرى في CL شفوي، مثل SR، هو أقل وضوحا، والبيانات المتعلقة الخلايا الجذعية في اللحمة المتوسطة 18 و CL في اللغات ليست سوى بداية في الظهور.
باستخدام نموذج القاطعة الماوس، عملت عدد من المجموعات لتوضيح مسارات الجينية والعمليات البيولوجية الخلايا الجذعية تشارك في تجديد الجهاز القائم على الخلايا الطبيعية. ومع ذلك، فإن CL شفوي يحتوي على عدد قليل نسبيا من الخلايا، تشير التقديرات إلى أن حوالي 5،000 في القاطعة الماوس، مما يجعل العمل مع الخلايا الأولية التحدي. لذلك، بذلت جهود للثقافة وتوسيع هذه الخلايا في المختبر 6،16،19،20 من أجل فتح أبواب جديدة للمناهج التجريبية التي ليست قابلة للتحقيق في الجسم الحي. وقد أظهرت الدراسة الأخيرة أن هذه الخلايا يمكن أن كلا تجديد الذات والتمايز إلى أميلوجينين معربا عن الخلايا عند مثقف 13. هنا، نحن تصف ويبرهن على وجود طريقة لالالبريد ثقافة موثوقة ومتسقة من الخلايا من شفوي الماوس CL.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت الخلايا الظهارية الأولى بنجاح مثقف 40 عاما مضت أكثر من 21-24، وفي الآونة الأخيرة، والعزلة الناجحة من الخلايا الجذعية الظهارية 25-27 وقد تقدمت معرفتنا البيولوجيا الظهارية. نفيدكم بروتوكول للعزل DESCs من القاطعة الماوس الكبار، يبلغ عدد سكانها سلوكه نسبيا من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر شيوى بينغ وانغ للمساعدة أولية مع الثقافات DESC. تمول من الكتاب في جزء من المنح الدراسية والمنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (K99-DE022059 لAHJ، K12-GM081266 إلى MGC، K08-DE022377-02 لOH، وR01-DE021420 إلى ODK).
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
References
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
