Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor
Summary
De voortdurend groeiende muis snijtand is een model voor het bestuderen van de vernieuwing van tandweefsel van tandheelkundige epitheliale stamcellen (DESCs). Een robuust systeem voor consistente en betrouwbare wijze verkrijgen van deze cellen van de snijtanden en de uitbreiding van deze in vitro wordt hier gemeld.
Abstract
Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die tand regeneratie en vernieuwing ten grondslag liggen is uitgegroeid tot een onderwerp van groot belang 1-4, en de muis snijtand biedt een model voor deze processen. Deze opmerkelijke orgaan groeit continu gedurende het hele leven van het dier en genereert alle benodigde celtypen uit actieve pools van volwassen stamcellen gehuisvest in de labiale (in de richting van de lip) en linguale (in de richting van de tong) cervicale lus (CL) regio's. Alleen de dentale stamcellen van de labiale CL leiden tot ameloblasts dat glazuur, de buitenste laag van de tanden, op de labiale oppervlak genereren. Deze asymmetrische emaille formatie kan schuren tegen de snijtanden uiteinde en progenitors en stamcellen in het proximale snijtand zodat het tandweefsel voortdurend aangevuld. Het vermogen om te isoleren en te groeien deze voorlopercellen of stamcellen in vitro kan de expansie en opent deuren talrijke experimenten niet haalbaar in vivo, zoals hoge throughput testen van potentiële stamcellen regulerende factoren. Hier hebben we beschrijven en demonstreren een betrouwbare en consistente methode om de cultuur cellen van de labiale CL van de muis snijtand.
Introduction
Een van de unieke kenmerken van vertebraten is de evolutie van tanden. De tand is uitgegroeid tot een belangrijk modelsysteem voor veel gebieden van onderzoek, en de moleculaire mechanismen morfologische specialisaties om dit orgel relevant zijn onderzocht vanuit verschillende perspectieven, onder meer door de ontwikkeling en evolutiebiologen 5. Meer recent, het gebied van regeneratieve geneeskunde is begonnen om waardevolle inzichten te krijgen met behulp van de tand als model. Met name de ontdekking van tandheelkundige epitheliale stamcellen een belangrijke vooruitgang 6-13 geweest.
Alle knaagdieren hebben continu groeiende snijtanden waarvan de groei wordt gevoed door stamcellen, waardoor deze tanden een toegankelijk modelsysteem om volwassen stamcellen regelgeving te bestuderen. Labeling experimenten 1970 10,11, gevolgd door genetische lineage tracing 8,9,12,14 experimenten hebben aangetoond dat DESCs in het proximale gebied van de snijtand bevinden. De steelcel nageslacht in de epitheliale compartiment aan de labiale zijde verhuizing uit de vermeende niche, bekend als de labiale cervicale lus (CL), en bijdragen aan een populatie van cellen genoemd-transit versterken (TA) cellen (figuur 1). Concreet DESCs wonen in de buitenste glazuur epitheel (OEE) en gestraalde reticulum (SR) 8,9,14, en de binnenste emaille epitheel (IEE) geeft aanleiding tot de TA-cellen die vooruitgang door middel van een beperkt aantal celcycli en dan bewegen distaal langs de lengte van de snijtand (figuur 1). De onderscheidende ameloblasts in de muis snijtand verder distaal bewegen langs de snijtanden op een opmerkelijke snelheid van ongeveer 350 um in een enkele dag 15,16. Als ze bewegen, de cellen differentiëren tot rijpe ameloblasts en stratum intermedium (SI) cellen. Na het afzetten van de volledige dikte van glazuurmatrixeiwitten, veel ameloblasts apoptose en de resterende cellen kleiner worden en reguleren emaille rijping <sup> 17. De lijn van de andere celtypes in het labiale CL, zoals SR, minder duidelijk, en gegevens over de stamcellen in het mesenchym 18 en de linguale CL alleen beginnen te ontstaan.
Met de muis snijtand model, een aantal groepen hebben gewerkt om de genetische wegen en celbiologische processen die betrokken zijn in de natuurlijke basis van stamcellen orgel vernieuwing toe te lichten. De labiale CL een relatief klein aantal cellen geschat op ongeveer 5.000 per muis snijtand, waardoor het werken met primaire cellen uitdagend. Daarom zijn pogingen gedaan om de cultuur en vergroten deze cellen in vitro 6,16,19,20 om nieuwe deuren experimentele benaderingen die niet haalbaar in vivo. De meest recente studie heeft aangetoond dat deze cellen kunnen zowel zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in amelogenin expressie cellen indien gekweekt 13. Hier beschrijven we en een werkwijze voor e tonene betrouwbare en consistente cultuur van cellen van de muis labiale CL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitheelcellen werden voor het eerst met succes gekweekt meer dan 40 jaar geleden 21-24, en meer recentelijk, succesvolle isolatie van epitheliale stamcellen 25-27 heeft geavanceerde onze kennis van epitheliale biologie. Wij rapporteren een protocol voor het isoleren van de DESCs van de volwassen muis snijtand, een relatief weinig bestudeerd populatie van stamcellen die het potentieel om belangrijke inzichten in tandheelkundige biologie en emaille vorming opbrengst heeft. Dit protocol werd aanvanke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Xiu-Ping Wang voor eerste hulp bij DESC culturen. De auteurs worden deels gefinancierd door beurzen en subsidies van de National Institutes of Health (K99-DE022059 om AHJ, K12-GM081266 naar MGC, K08-DE022377-02 tot OH, en R01-DE021420 te ODK).
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
References
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
