Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones
Summary
Este video muestra un método, utilizando una clínica 3 T escáner, por contraste mejorado la RM del ratón proyección visual ingenuo y para estudios repetitivos y longitudinales en vivo de la degeneración del nervio óptico asociadas con lesión por aplastamiento del nervio óptico aguda y degeneración del nervio óptico crónica en ratones knock-out (KO p50).
Abstract
El sistema visual roedor abarca las células ganglionares de la retina y sus axones que forman el nervio óptico para entrar en los centros talámicos y del cerebro medio, y proyecciones postsinápticos a la corteza visual. Sobre la base de su estructura anatómica distinta y la accesibilidad conveniente, se ha convertido en la estructura favorecida para los estudios sobre la supervivencia neuronal, la regeneración axonal, y la plasticidad sináptica. Los recientes avances en la RM han permitido la visualización in vivo de la parte retino tectal de esta proyección utilizando manganeso mediada aumento del contraste (MEMRI). A continuación, presentamos un protocolo MEMRI para ilustración de la proyección visual en ratones, mediante el cual las resoluciones de (200 m) 3 se puede lograr utilizando escáneres comunes 3 Tesla. Demostramos cómo la inyección intravítrea de una sola dosis de 15 nmol MnCl2 conduce a una mejora de la proyección saturada intacta dentro de 24 horas. Con excepción de la retina, se indepen cambios en la intensidad de la señaldente de la estimulación visual coincidió o envejecimiento fisiológico. Aplicamos aún más esta técnica para supervisar longitudinalmente degeneración axonal en respuesta a la lesión aguda del nervio óptico, un paradigma por el que Mn 2 + transporte completamente detenciones en el sitio de la lesión. Por el contrario, el transporte activo de Mn + 2 es cuantitativamente proporcional a la viabilidad, el número y la actividad eléctrica de las fibras de axones. Para un análisis de este tipo, ejemplificamos Mn 2 + cinética de transporte a lo largo del camino visual en un modelo de ratón transgénico (p50 NF-kB KO) mostrando atrofia espontánea de los sentidos, incluyendo visuales, proyecciones. En estos ratones, MEMRI indica reducida pero no retardada Mn 2 + de transporte en comparación con ratones de tipo salvaje, lo que revela signos de alteraciones estructurales y / o funcionales por mutaciones NF-kB.
En resumen, MEMRI puentes convenientemente en ensayos in vivo y post mortem para la histología characterizatisobre la integridad y la actividad de las fibras nerviosas. Es muy útil para los estudios longitudinales sobre la degeneración axonal y la regeneración, y las investigaciones de los ratones mutantes para fenotipos genuinos o inducibles.
Introduction
Sobre la base de su estructura neuro-anatómico favorable el sistema visual del roedor ofrece posibilidades únicas para evaluar compuestos farmacológicos y su capacidad para mediar en la neuroprotección 1 o efectos pro-regenerativas 2,3. Por otra parte, permite que los estudios sobre las características funcionales y neuro-anatómico de ratones mutantes, en fecha tan reciente ejemplifica para los ratones que carecen de la proteína de andamiaje presináptico Fagot 4. Además, un amplio espectro de herramientas complementarias ofrece que ofrece adicional de células de la retina ganglio (RGC) y los números de los axones de CGR así como la actividad de RGC, por ejemplo, por el electrorretinograma y pruebas de comportamiento, y la determinación de los reordenamientos corticales por imagen óptica de señales intrínsecas. Las últimas novedades técnicas en microscopía láser permiten una visualización in situ de regeneración RGC por imágenes de fluorescencia de tejido profundo en el conjunto de montaje de especímenes del nervio óptico (NO) y el cerebro. En este histopatología,enfoque ical, tetrahidrofurano basado claro tejido en combinación con hoja de luz de microscopía de fluorescencia permite la resolución de las fibras individuales que se vuelva a introducir en el SOBRE deafferented y el tracto 5 óptica. Si bien tales técnicas pueden ser superiores en la resolución y la determinación de los patrones de crecimiento, que no permiten análisis repetitivos y longitudinales de los eventos individuales de crecimiento, que son particularmente deseables para evaluar el proceso de regeneración a largo plazo.
Mejorada de contraste de RM ha sido empleado para la visualización mínima invasiva de la proyección retino-tectal en ratones y ratas 6,7. Esto puede lograrse mediante la entrega intraocular directa de iones paramagnéticos (por ejemplo, Mn 2 +) a células de la retina. Como un análogo de calcio, Mn 2 + se incorpora en RGC somata a través de canales de calcio dependientes de voltaje y transportados activamente a lo largo del citoesqueleto axonal del EN intacto y tracto óptico. Mientras se acumula en núcleos cerebralesde la proyección visual, es decir, el núcleo geniculado lateral (LGN) y colículo superior (SC), la propagación transsynaptic en la corteza visual primaria parece insignificante 8,9, aunque puede ocurrir 10,11. Bajo secuenciación MR, paramagnético Mn 2 + aumenta el contraste MR principalmente por el acortamiento T1 spin-red tiempo de relajación 12. Tal Mn 2 + mejorado MRI (MEMRI) ha sido aplicado con éxito en varios estudios de neuro-anatómicas y funcionales de las ratas, incluida la evaluación de la regeneración axonal y degeneración después de la lesión SOBRE 13,14, el mapeo anatómico preciso de la proyección de 15 retino tectal , así como la determinación de las características de transporte axonal después del tratamiento farmacológico 16. Mejoras recientes en la dosis, la toxicidad, y la cinética de los protocolos de RM neuronales Mn 2 + captación y el transporte, así como la mejora han extendido su aplicación a los estudios sobre transgénicos9 ratones utilizando escáneres de 3 Tesla de uso común en la práctica clínica 17.
Aquí, se presenta un protocolo adecuado para MEMRI longitudinal de imágenes in vivo del ratón proyección retino tectal y ejemplificar su aplicación mediante la evaluación de mejora de la señal de Mn 2 + dependientes en condiciones de neurodegeneración ingenuos y varios. Nuestro protocolo pone especial énfasis en la adquisición de datos de RM en un campo magnético moderado 3 T, que generalmente es más accesible que los escáneres de los animales dedicados. En los ratones no tratados previamente, se expone cómo la intensidad de señal del tracto específico puede ser sustancialmente y reproducible convertirse aumentado después intravítrea (ivit) Mn 2 + aplicación. Cuantitativamente, Mn 2 + de propagación a lo largo de la proyección visual se produce independientemente del proceso de envejecimiento normal (medida entre los ratones 3 y 26 meses de edad) y el aumento es refractario a la estimulación visual y la adaptación a la oscuridad. En contraste, Mn <shasta> 2 + enriquecimiento en los centros talámicos y cerebro medio se reduce siguientes efectos agudos EN lesión por aplastamiento 18, así como en NFKB1 ratones knock-out (KO p50) que sufren de la muerte de las CGR apoptosis espontánea y la degeneración de 19. Por lo tanto, en la expansión a análisis histológico convencional, el análisis de MEMRI longitudinal de animales individuales permite perfiles de la cinética únicas de procesos neurodegenerativos. Esto puede ser muy útil para los estudios sobre la neuroprotección y la regeneración axonal asociada con las intervenciones farmacológicas o genéticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEMRI del sistema visual se extiende técnicas neurobiológicos convencionales para evaluar la funcionalidad en condiciones no tratados previamente y patológicos. Además de proporcionar una visión única de la integridad de un hecho aislado CNS tracto de fibras, MEMRI puede ser fácilmente complementado con pruebas de comportamiento, por ejemplo, optometría y tareas a base de agua visualmente, para investigar las consecuencias inmediatas de un determinado paradigma de la percepción visual. También vincula…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AK es apoyado por la Fundación Oppenheim y RH con el apoyo de la Fundación Velux. Agradecemos I. Krumbein de técnica y K. Buder apoyo histológico, y J. Goldschmidt (Instituto Leibniz de Neurobiología, Magdeburg, Alemania) para el asesoramiento técnico en la tinción de TIMM.
Materials
| Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
| Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
| Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
| Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
| Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
| 34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
| Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| 3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
| Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
| Mouse holder | custom made | ||
| Red light lamp | |||
| Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
| Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
| gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
| Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
| Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
| Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 | |
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