Summary

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

Published: July 22, 2014
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Summary

Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 KO).

Abstract

Il sistema visivo roditore comprende cellule gangliari della retina e dei loro assoni che formano il nervo ottico per entrare nei centri talamo e mesencefalo, e proiezioni postsinaptici alla corteccia visiva. Sulla base della sua struttura anatomica distinta e comoda accessibilità, è diventato la struttura preferita per gli studi sulla sopravvivenza neuronale, rigenerazione assonale, e la plasticità sinaptica. Recenti progressi in RM hanno permesso la visualizzazione in vivo della parte retino-tectal di questa proiezione utilizzando manganese mediata aumento del contrasto (MEMRI). Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI per l'illustrazione della proiezione visiva nei topi, da cui risoluzioni (200 micron) 3 possono essere raggiunti utilizzando comuni 3 scanner Tesla. Dimostriamo come l'iniezione intravitreale di una singola dose di 15 nmol MnCl 2 porta ad un miglioramento saturo della proiezione intatto entro 24 ore. Con eccezione della retina, cambiamenti di intensità del segnale sono indisidente della coincisa stimolazione visiva o invecchiamento fisiologico. Applichiamo ulteriormente questa tecnica per monitorare longitudinalmente degenerazione assonale in risposta al danno del nervo ottico acuto, un paradigma con il quale Mn 2 + trasporto completamente arresti presso il sito di lesione. Al contrario, attivo Mn 2 + trasporto è quantitativamente proporzionale alla vitalità, il numero e l'attività elettrica delle fibre assoni. Per tale analisi, rappresentiamo Mn 2 + cinetiche di trasporto lungo il percorso visivo in un modello di topo transgenico (NF-kB p50 KO) visualizzando atrofia spontanea di sensoriali, tra cui visivi, proiezioni. In questi topi, MEMRI indica ridotta ma non ritardato Mn 2 + trasporto rispetto ai topi wild type, rivelando così segni di alterazioni strutturali e / o funzionali da mutazioni NF-KB.

In sintesi, MEMRI ponti comodamente in vivo e post mortem istologia per il characterizatisu integrità e l'attività delle fibre nervose. E 'molto utile per studi longitudinali sulla degenerazione assonale e rigenerazione, e ricerche di topi mutanti per fenotipi originali o inducibili.

Introduction

Sulla base della sua struttura neuro-anatomica favorevole il sistema visivo roditore offre possibilità uniche per valutare composti farmacologici e la loro capacità di mediare neuroprotezione 1 o effetti pro-rigenerativi 2,3. Inoltre, per studi sulle caratteristiche funzionali e neuro-anatomica di mutanti di topo, come recentemente esemplificato per topi privi della proteina ponteggio presinaptica Bassoon 4. Inoltre, un ampio spettro di strumenti supplementari permette supplementare con delle cellule gangliari retiniche (RGC) e numeri assoni RGC nonché attività RGC, ad esempio, da elettroretinografia e test comportamentali, e la determinazione di riarrangiamenti corticali mediante imaging ottico di segnali intrinseci. Gli ultimi sviluppi tecnici in microscopia laser consentono di visualizzazione situ di RGC rigenerazione profonda dei tessuti imaging di fluorescenza in interi esemplari di montaggio delle nervo ottico (ON) e il cervello. In questo histologapproccio iCal, tetraidrofurano basato radura del tessuto in combinazione con foglio leggero microscopia a fluorescenza permette la risoluzione delle singole fibre che ri-entrare nel deafferented ON e tratto ottico 5. Mentre tali tecniche possono essere superiori in risoluzione e determinazione della curva di crescita, non consentono analisi ripetitive e longitudinali di eventi di crescita individuali, particolarmente desiderati per valutare il processo di rigenerazione lungo termine.

Contrasto-enhanced MRI è stata impiegata per la visualizzazione minima invasività della proiezione retino-tectal in topi e ratti 6,7. Ciò può essere ottenuto mediante consegna intraoculare diretta di ioni paramagnetici (ad esempio, Mn 2 +) di cellule retiniche. Come un analogo calcio, Mn 2 + è incorporato in RGC somata tramite i canali del calcio voltaggio-dipendenti e attivamente trasportati lungo il citoscheletro assonale della ON intatta e tratto ottico. Mentre si accumula nei nuclei cerebralidella proiezione visiva, cioè il nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore (SC), la propagazione transsynaptic nella corteccia visiva primaria appare trascurabile 8,9, anche se può verificarsi 10,11. Sotto MR sequenziamento, paramagnetica Mn 2 + Potenziati MR contrasto principalmente accorciando T 1 spin-reticolo tempo di rilassamento 12. Tale Mn 2 + migliorato MRI (MEMRI) è stato applicato con successo in diversi studi neuro-anatomici e funzionali di ratti, compresa la valutazione della rigenerazione assonale e la degenerazione dopo sul pregiudizio 13,14, la precisa mappatura anatomica della proiezione 15 retino-tectal , nonché la determinazione delle caratteristiche trasporto assonale dopo il trattamento farmacologico 16. Recenti ricerche nel dosaggio, tossicità, e la cinetica dei protocolli MRI neuronali Mn 2 + assorbimento e il trasporto, nonché il miglioramento hanno esteso la sua applicazione agli studi sui transgenicitopi 9 con 3 scanner Tesla comunemente utilizzati nella pratica clinica 17.

Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI adatto longitudinale imaging in vivo del mouse retino-tectal proiezione ed esemplificare la sua applicabilità valutando Mn 2 + dipendente potenziamento del segnale in condizioni di neurodegenerazione ingenue e vari. Il nostro protocollo pone particolare enfasi sulla acquisizione dati MR in un moderato 3 T campo magnetico che è generalmente più accessibile rispetto agli scanner di animali dedicati. Nei topi naive, illustriamo come intensità di segnale specifico tratto può essere sostanzialmente e riproducibile diventare aumentata dopo intravitreale (ivit) Mn 2 + applicazione. Quantitativamente, Mn 2 + propagazione lungo la proiezione visiva si verifica indipendentemente dal normale processo di invecchiamento (misurata tra 3 e 26 mesi di età topi) e aumento è refrattario alla stimolazione visiva e l'adattamento all'oscurità. Al contrario, Mn <sup> 2 + arricchimento nei centri talamo e mesencefalo è diminuita a seguito acuta ON lesione da schiacciamento 18, così come in NFKB1 topi knock-out (p50 KO) affetti da spontanea morte apoptotica RGC e sulla degenerazione 19. Così, in espansione per analisi istologica convenzionale, longitudinale analisi MEMRI singoli animali ha la profilatura della cinetica uniche di processi neurodegenerativi. Questo dovrebbe rivelarsi utile per gli studi sulla neuroprotezione e rigenerazione assonale associati a interventi farmacologici o genetici.

Protocol

Tutti gli interventi di animali vengono eseguite in conformità con la Convenzione europea per la cura degli animali ed uso di animali da laboratorio e la Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Tutti gli esperimenti sono approvate dal comitato etico locale. La procedura di lesioni ON nei topi è descritto altrove 9. 1. Intravitreali Manganese Injection Eseguire la Mn 2 + iniezione di 24 ore prima della MR…

Representative Results

La capacità di questa tecnica di imaging per valutare con precisione la vitalità e la funzionalità della proiezione visiva si basa su una precisa applicazione di un tossico Mn 2 + dosaggio al corpo vitreo e il suo assorbimento da RGC. Questo importante assunzione viene testato in Figura 1, dove strato specifico Mn 2 + assorbimento è dimostrato dal autometallography (TIMM colorazione) 21. Sezioni retina sono state analizzate a 24 ore dopo l'applicazione di una <em…

Discussion

MEMRI del sistema visivo si estende tecniche neurobiologiche convenzionali per valutare la funzionalità in condizioni ingenue e patologiche. Oltre ad una visione unica l'integrità di un isolato fibra tratto CNS, MEMRI può essere facilmente integrato con test comportamentali, per esempio, optometria e compiti a base di acqua visivamente, di indagare le conseguenze immediate di un dato paradigma per la percezione visiva. Si collega anche elettrofisiologici e le indagini istologiche con caratterizzazione vi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AK è sostenuta dalla Fondazione Oppenheim e RH è supportato dalla Fondazione Velux. Ringraziamo I. Krumbein per Buder tecnica e K. per il sostegno istologico, e J. Goldschmidt (Istituto Leibniz di Neurobiologia, Magdeburgo, Germania) per un parere tecnico su TIMM colorazione.

Materials

Manganese (II) chloride solution 1M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Isoflurane Actavis, Munich, Germany PZN 7253744
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G  needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion 
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

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Cite This Article
Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

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