Imagem in vivo da fibra óptica Nerve Integrity por ressonância magnética com contraste em Ratos

Summary

Este vídeo ilustra um método, usando um scanner T clínica 3, por MR com contraste de imagem da projeção visual ingênuo do mouse, para estudos in vivo repetitivos e longitudinais de degeneração do nervo óptico associados com lesão por esmagamento do nervo óptico aguda e degeneração do nervo óptico crônica em camundongos knock-out ^(KO p50).

Abstract

O sistema visual de roedores engloba células ganglionares da retina e seus axônios que formam o nervo óptico para entrar centros tálamo e mesencéfalo, e projeções pós-sinápticos para o córtex visual. Com base na sua estrutura anatómica distinta e acessibilidade conveniente, tornou-se a estrutura preferida para estudos sobre a sobrevivência neuronal, regeneração axonal, e plasticidade sináptica. Os recentes avanços na ressonância magnética permitiram a visualização in vivo da parte retino-tectal dessa projeção usando manganês mediada realce de contraste (MEMRI). Aqui, apresentamos um protocolo MEMRI para ilustração da projeção visual em camundongos, pelo qual resoluções de (200 mm) ³ pode ser conseguido usando scanners comuns 3 Tesla. Demonstramos como injecção intravítrea de uma única dose de 15 nmol de _MnCl2 conduz a um acessório saturada de projecção intacto dentro de 24 horas. Com exceção da retina, alterações na intensidade do sinal são indedente de estimulação visual coincidiu ou envelhecimento fisiológico. Aplicamos ainda mais essa técnica para monitorar longitudinalmente degeneração axonal em resposta à lesão do nervo óptico aguda, um paradigma pelo qual Mn ^{2 +} transporte completamente prisões no local da lesão. Por outro lado, Mn ^{2 +} transporte ativo é quantitativamente proporcional à viabilidade, número e atividade elétrica das fibras de axônio. Para tal análise, exemplificamos Mn ^{2 +} cinética de transporte ao longo do caminho visual em um modelo de camundongo transgênico (NF-kB p50 ^KO) exibindo atrofia espontânea de sensorial, incluindo visuais, projeções. Nestes ratos, MEMRI indica reduzida mas não retardada de Mn ^{2 +} transporte, em comparação com ratinhos de tipo selvagem, revelando sinais de deficiências estruturais e / ou funcionais, por mutações de NF-kB.

Em resumo, MEMRI convenientemente pontes ensaios in vivo e post mortem histologia para o characterizatina de integridade e atividade de fibras nervosas. É muito útil para estudos longitudinais sobre degeneração e regeneração axonal e investigações de ratos mutantes para fenótipos genuínos ou induzidas.

Introduction

Com base na sua estrutura neuro-anatômica favorável do sistema visual de roedores oferece possibilidades únicas para avaliar compostos farmacológicos e sua capacidade de mediar neuroproteção ¹ ou efeitos pró-regenerativas ^2,3. Além disso, ele permite que os estudos sobre as características funcionais e neuro-anatômica de mutantes do rato, como recentemente exemplificado para camundongos sem a proteína andaimes pré-sináptico Fagote ^4. Além disso, um amplo espectro de ferramentas complementares proporciona adicional que caracteriza de células da retina gânglio (RGC) e os números de axónios RGC, bem como a actividade das CGR, por exemplo, por electrorretinografia e testes comportamentais, e a determinação de rearranjos corticais por imagiologia óptica de sinais intrínsecos. Os últimos desenvolvimentos técnicos em microscopia a laser permitem a visualização em situ de RGC regeneração por tecidos profundos imagens de fluorescência em amostras inteiras de montagem de nervo óptico (ON) e cérebro. Neste histológicoabordagem iCal, tetra baseado compensação tecido em combinação com a microscopia de fluorescência de luz folha permite a resolução de fibras individuais que re-entrar no ON desaferentada e trato óptico ^5. Enquanto tais técnicas pode ser superior na resolução e determinação de padrões de crescimento, eles não permitem análises repetitivas e longitudinais de acontecimentos individuais de crescimento, as quais são particularmente desejados para avaliar o processo de regeneração a longo prazo.

RM contrastada tem sido empregada para a visualização minimamente invasiva da projeção retino-tectal em camundongos e ratos ^6,7. Isto pode ser conseguido por entrega intra-ocular directa de iões paramagnéticos (por exemplo, Mn ^{2 +)} para as células da retina. Como um análogo de cálcio, Mn ^{2 +} é incorporada RGC somata através de canais de cálcio dependentes da voltagem e ativamente transportado ao longo do citoesqueleto axonal do ON intacta e trato óptico. Enquanto se acumula nos núcleos do cérebroda projecção visual, isto é, o núcleo geniculado lateral (LGN) e colículo superior (SC), a propagação transsináptica no córtex visual primário parece insignificante ^8,9, embora possa ocorrer ^10,11. Sob MR seqüenciamento, paramagnética Mn ^{2 +} aumenta MR contraste principalmente pelo encurtamento _T1 spin-rede tempo de relaxamento ^12. Tal Mn ^{2 +} reforçada MRI (MEMRI) tem sido aplicado com sucesso em vários estudos neuro-anatômicas e funcionais de ratos, incluindo a avaliação da regeneração axonal e degeneração após ON lesão ^13,14, o mapeamento anatômico preciso da ¹⁵ projeção retino-tectal , bem como a determinação das características de transporte axonal após o tratamento farmacológico ^16. Refinamentos recentes na dosagem, toxicidade e cinética de protocolos de ressonância magnética neuronais Mn ^{2 +} absorção e transporte, bem como melhorados têm estendido a sua aplicação aos estudos sobre transgênicosratinhos ⁹ utilizando 3 scanners Tesla vulgarmente utilizados na prática clínica ^17.

Aqui, apresentamos um protocolo adequado para MEMRI longitudinal in vivo de imagens da projeção retino-tectal rato e exemplificar sua aplicabilidade avaliando Mn ^{2 +} aumento do sinal dependente em condições neurodegeneração ingênuos e vários. Nosso protocolo coloca especial ênfase para a aquisição de dados em um MR 3 T campo magnético moderado que geralmente é mais acessível do que os scanners de animais dedicados. Em camundongos ingênuos, que ilustram como a intensidade do sinal específico do trato pode ser substancialmente e reproduzível tornar aumentou após intravítrea (ivit) Mn ^{2 +} aplicação. Quantitativamente, Mn ^{2 +} propagação ao longo da projeção visual ocorre independentemente do processo de envelhecimento normal (medido entre os ratos 3 e 26 meses de idade) e de aumento é refratário a estimulação visual e adaptação à escuridão. Em contraste, Mn <sup> 2 + enriquecimento em centros tálamo e mesencéfalo é diminuída seguinte aguda ON lesão por esmagamento ^18, bem como em NFKB1 camundongos knock-out ^(KO p50) que sofrem de morte espontânea RGC apoptose e na degeneração ^19. Assim, em expansão para análise histológica convencional, análise MEMRI longitudinal de animais individuais permite perfis de cinética únicas de processos neurodegenerativos. Isso deve ser útil para estudos sobre a neuroproteção e regeneração axonal associados com intervenções farmacológicas ou genéticas.

Protocol

Todas as intervenções animais são realizados em conformidade com a Convenção Europeia para a Animal Care e Uso de Animais de Laboratório ea Demonstração ARVO para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética local. O procedimento de lesão ON em ratos é descrito em outra parte 9. 1. Intravítrea Manganês Injeção Realize o Mn 2 + injeção 24 horas antes do MR var…

Representative Results

A capacidade desta técnica de imagem para avaliar com precisão a vitalidade ea funcionalidade da projeção visual depende a aplicação precisa de um atóxico Mn 2 + dosagem para o corpo vítreo e sua absorção pelas CGR. Este pressuposto importante é testado na Figura 1, onde específica Mn 2 + absorção camada é demonstrada por autometallography (coloração TIMM) 21. Secções da retina foram analisados ​​às 24 h após a aplicação de ivit ou 15 …

Discussion

MEMRI do sistema visual estende técnicas neurobiológicas convencionais para avaliar a funcionalidade em condições ingênuos e patológicos. Além de oferecer uma perspectiva única sobre a integridade de um isolado CNS trato fibra, MEMRI pode ser facilmente complementada com testes comportamentais, por exemplo, optometria e tarefas de água com base visualmente, para investigar as conseqüências imediatas de um determinado paradigma para a percepção visual. Ela também liga eletrofisiológico e investiga…

Materials

Manganese (II) chloride solution 1M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Isoflurane	Actavis, Munich, Germany	PZN 7253744
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G  needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908