Denna video visar en metod, med hjälp av en klinisk 3 T scanner, för kontrastförstärkt MR-avbildning av naiva musen visuell projektion och för repetitiva och longitudinella in vivo-studier av synnerven degeneration i samband med akut synnerven krosskada och kronisk synnerven degeneration i knock-out-möss (p50 KO).
Den gnagare visuella systemet omfattar näthinneganglieceller och deras axoner som bildar synnerven ange talamiska och mitthjärnan center och postsynaptiska prognoser till syncentrum. Utifrån sin distinkta anatomiska struktur och bekväm tillgänglighet, har det blivit gynnad struktur för studier av neuronal överlevnad, axonal regeneration, och synaptisk plasticitet. Nya framsteg inom MR har möjliggjort visualisering av Retino-tectal del av denna projektion med hjälp av mangan medierad kontrastförbättring (MEMRI) in vivo. Här presenterar vi en MEMRI protokoll för illustration av visuell projektion i möss, genom vilka resolutioner (200 nm) 3 kan åstadkommas med hjälp av vanliga 3 Tesla skannrar. Vi visar hur intravitreal injektion av en enda dos av 15 nmol MnCl2 leder till en mättad förbättring av den intakta projektion inom 24 timmar. Med undantag av näthinnan, är förändringar i signalintensitet oberoende av sammanföll visuell stimulans eller fysiologiska åldrande. Vi tillämpar vidare denna teknik för att på längden övervaka axonal degeneration till följd av akut optisk nervskada, ett paradigm av vilken Mn 2 + transport helt gripanden vid skadestället. Omvänt är aktiv Mn 2 + transport kvantitativt proportion till lönsamhet, antal, och elektriska aktivitet axon fibrer. För en sådan analys, vi exemplifiera Mn 2 + transport kinetik längs den visuella vägen i en transgen musmodell (NF-kB p50 KO) visar spontan atrofi av sensoriska, inklusive visuella, projektioner. I dessa möss, visar MEMRI minskat, men inte försenas Mn 2 + transporter jämfört med vildtyp möss, vilket visar tecken på strukturella och / eller funktionsnedsättningar av NF-kB-mutationer.
Sammanfattningsvis MEMRI överbryggar lämpligen in vivo och efter slakt histologi för characterizatiden av nervfiber integritet och aktivitet. Det är mycket användbart för longitudinella studier på axonal degeneration och regeneration, och undersökningar av muterade möss för äkta eller inducerbara fenotyper.
Utifrån sin gynnsamma neuro-anatomiska struktur gnagare visuella systemet erbjuder unika möjligheter att utvärdera farmakologiska föreningar och deras förmåga att fungera som neuroprotektion 1 eller pro-regenerativa effekter 2,3. Dessutom tillåter det studier om de funktionella och neuro-anatomiska egenskaper mutanter mus, som nyligen exemplifieras för möss som saknar den presynaptiska byggnadsställningar proteinet Fagott 4. Dessutom ett brett spektrum av kompletterande verktyg ger ytterligare med av retinal ganglion celler (RGC) och RGC axon nummer samt RGC aktivitet, t.ex. genom elektroretinografi och beteendetester, och fastställandet av kortikala omdisponeringar av optisk avbildning av inre signaler. Den senaste tekniska utvecklingen inom laser mikroskopi möjliggör in situ-visualisering av RGC förnyelse av djup vävnad fluorescens avbildning i hela montera exemplar av synnerven (ON) och hjärna. I detta histological tillvägagångssätt, tetrahydrofuran baserad vävnad clearing i kombination med ljus plåt fluorescensmikroskopi tillåter upplösning av enstaka fibrer som återinträda i deafferenterad ON och optisk kanalen 5. Även om sådana metoder kan vara överlägsen i upplösning och bestämning av tillväxtmönster, gör de det inte möjligt för repetitiva och longitudinella analyser av enskilda tillväxt händelser, som är särskilt önskvärda för att bedöma processen för långsiktig förnyelse.
Kontrastförstärkt MRT har varit anställd för minimal invasiv visualisering av Retino-tectal projektion på möss och råttor 6,7. Detta kan uppnås genom direkt intraokulär avgivning av paramagnetiska joner (t.ex. Mn2 +) till retinala celler. Som en kalcium analog, Mn 2 + inkorporeras i RGC somata via spänningsstyrda kalciumkanaler och aktivt transporteras längs axonal cytoskelettet av den intakta ON och optisk vägarna. Även om det ackumuleras i hjärnkärnorav den visuella projektion, dvs sido geniculate kärnan (LGN) och överlägsen colliculi (SC), transsynaptisk utbredning i den primära syncentrum förefaller försumbar 8,9, även om det kan förekomma 10,11. Under MR-sekvensering, paramagnetiska Mn 2 + förstärker MR kontrast främst genom att förkorta T 1 spin-lattice relaxationstiden 12. Sådana Mn 2 + förstärkt MRT (MEMRI) har med framgång tillämpats inom olika neuro-anatomiska och funktionella studier av råttor, däribland uppskattning av axonal regeneration och degeneration efter ON skada 13,14, exakt anatomisk kartläggning av Retino-tectal projektion 15 samt fastställande av axonal egenskaper transport efter farmakologisk behandling 16. Nya förbättringar i doserings, toxicitet och kinetik neuronala Mn 2 + upptag och transport, samt förbättrade MRI-protokoll har utökat sin ansökan till studier på transgenamöss 9 med användning av 3 Tesla scanners som vanligen används i klinisk praxis 17.
Här presenterar vi en MEMRI protokoll som lämpar sig för längs in vivo avbildning av musen Retino-tectal projektion och exemplifiera dess tillämplighet genom att bedöma Mn 2 + beroende signalförstärkning i naiva och olika neurodegeneration förhållanden. Vår protokoll lägger särskild vikt vid MR datainsamling i en måttlig 3 T magnetfält som är generellt mer tillgängliga än hängivna djur skannrar. I naiva möss, vi visar hur tarmspecifik signalstyrkan kan vara väsentligt och reproducerbart bli ökade efter intravitreal (ivit) Mn 2 + ansökan. Kvantitativt, Mn 2 + utbredning längs den visuella projektionen sker oberoende av det normala åldrandet (mätt mellan 3 och 26 månader gamla möss) och förstärkning är refraktär för visuell stimulans och anpassning till mörker. I kontrast, Mn <sdig> 2 + anrikning i talamus och mellanhjärnan centra minskar efter akut ON krosskada 18 liksom i nfkb1 knock-out-möss (p50 KO) som lider av spontan apoptotisk RGC-död och ON degeneration 19. Således, i expansionen till konventionella histologiska analys, längs MEMRI analys av enskilda djur möjliggör profilering av unika kinetik neurodegenerativa processer. Detta skulle visa sig användbart för studier om neuroprotektion och axonal regeneration förknippade med farmakologiska eller genetiska ingrepp.
MEMRI av det visuella systemet sträcker konventionell neurobiologiska tekniker för att bedöma funktionaliteten i naiva och patologiska tillstånd. Förutom att ge en unik inblick i integriteten för en isolerad CNS-fiber-tarmkanalen, kan MEMRI enkelt kompletteras med beteendetester, t.ex. optometri och visuellt baserade vatten uppgifter, för att undersöka de omedelbara konsekvenserna av en viss paradigm för visuell perception. Den länkar också elektrofysiologiska och histologiska undersökningar med fun…
The authors have nothing to disclose.
AK stöds av Oppenheim Foundation och RH stöds av Velux Foundation. Vi tackar I. Krumbein för teknisk och K. Buder för histologisk stöd, och J. Goldschmidt (Leibniz Institutet för neurobiologi, Magdeburg, Tyskland) för teknisk rådgivning om TIMM färgning.
Manganese (II) chloride solution 1M | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | M1787 | MEMRI contrast reagent |
Conjuncain | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 7617666 | 0.4% oxybuprocaine hydrochloride |
Floxal eye drops | Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany | PZN 3820927 | 3 mg/ml ofloxacin |
Ointment panthenol | Jenapharm, Jena, Germany | PZN 3524531 | |
Chloral hydrate | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | C8383 | 420-450 mg/kg body weight |
Isoflurane | Actavis, Munich, Germany | PZN 7253744 | |
Hamilton syringe | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 7634-01 | SYR 5 µl, 75 RN, no NDL |
34 G needle (34/35/pst4/tapN) | Hamilton Company, Reno, NV, USA | 207434/00 | removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4 |
Binocular Stemi-2000 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio | Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany | ||
Rat head coil | Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA | ||
Mouse holder | custom made | ||
Red light lamp | |||
Frozen section medium NEG-50 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany | 6502 | tissue embedding for cryo-sections |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) | Merck, Darmstadt, Germany | 106346 | for sulfide perfusion |
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) | Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany | 208043 | |
gum arabic | Roth, Arlesheim, Switzerland | 4159 | for TIMM staining |
Hydroquinone (C6H6O2) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 3586 | |
Citric acid (C6H8O7) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 6490 | |
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) | Merck, Darmstadt, Germany | 106448 | |
Silver nitrate (AgNO3) | Roth, Arlesheim, Switzerland | 7908 |