التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر
Summary
يصف هذا المقال بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون في المختبر باستخدام منظم الإضاءة مجهرية (SIM). فائقة الدقة باستخدام المجهر SIM توفر دقة وضوح الصورة بشكل كبير إلى أبعد من الحد حيود الضوء في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة، والسماح للتصوير العمود الفقري شجيري الفردية مع تحسين التفاصيل.
Abstract
العمود الفقري شجيري هي نتوءات الناشئة من التغصنات من الخلايا العصبية وتمثل الأهداف بعد المشبكي المدخلات الأولية مثير في الدماغ. وقد حددت هذه الهياكل التقدم التكنولوجي كعناصر رئيسية في اتصال الخلايا العصبية واللدونة متشابك. يبقى التحليل الكمي من التشكل العمود الفقري باستخدام المجهر الضوئي والمشكلة الأساسية بسبب القيود التقنية المرتبطة حد الانكسار الجوهرية للضوء. العمود الفقري شجيري يمكن تحديدها بسهولة من قبل متحد البؤر الليزر المسح المجهري مضان. ومع ذلك، وقياس التغيرات الطفيفة في الشكل والحجم في العمود الفقري صعب لأن أبعاد العمود الفقري غيرها من طول وعادة ما تكون أصغر من القرار البصرية التقليدية التي يحددها قرار الحد النظري المجهر الضوئي من 200 نانومتر.
وقد استخدمت العديد من التقنيات فائقة القرار وضعت مؤخرا لصورة الخلوية هياكل أصغر من 200 نانومتر، بما في ذلك العمود الفقري شجيري. Tوتستند تقنيات ذات المناظر على عمليات بعيدة الميدان الكلاسيكية، وبالتالي تسمح باستخدام أساليب إعداد العينات الموجودة وراء صورة سطح العينة. الموصوفة هنا هو بروتوكول عمل لتطبيق القرار السوبر منظم إضاءة المجهر (SIM) لتصوير العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين في الثقافات الأولية. التطبيقات الممكنة لSIM تتداخل مع تلك المجهري متحد البؤر. ومع ذلك، فإن اثنين من تقنيات تقديم انطباق مختلفة. يقدم SIM القرار الوحشي أعلى فعالة، في حين المجهري متحد البؤر، وذلك بسبب استخدام الثقب المادية، يحقق القرار التحسن على حساب إزالة من ضوء التركيز. في هذا البروتوكول، والخلايا العصبية الأولية هي مثقف على coverslips الزجاج باستخدام بروتوكول قياسي، transfected مع البلازميدات الحمض النووي ترميز البروتينات الفلورية وتصويرها باستخدام SIM. بروتوكول الموصوفة هنا كله يستغرق حوالي 2 أسابيع، ليتم تصوير العمود الفقري شجيري بعد 16-17 يوما في المختبر، عندالتنمية شجيري هو الأمثل. بعد الانتهاء من البروتوكول، العمود الفقري شجيري يمكن إعادة بنائها في 3D من سلسلة من مداخن صورة SIM باستخدام البرمجيات المتخصصة.
Introduction
A العمود الفقري شجيري هو نتوء صغير من غشاء الخلايا العصبية. وتتخصص هذه البنية المميزة لتلقي المدخلات عادة من المشبك واحد، ويمثل منطقة الاتصال الجسدي بين اثنين من الخلايا العصبية. تتكون معظم العمود الفقري شجيري ناضجة وظيفيا من طرف كروي، رئيس يطلق عليه، والعنق رقيقة الذي يربط الرأس إلى رمح شجيري. ومع ذلك، العمود الفقري ليست ثابتة وتتحرك بنشاط وتغيير التشكل بشكل مستمر حتى في الدماغ الكبار 2. خلال فترة 2 أسبوع من الوقت، الفئران الثقافات الخلايا العصبية قرن آمون الأولية المستمدة من أواخر الجنينية أو بعد الولادة المبكرة الوقت تطوير العرش شجيري معقدة مع العديد من نتوءات الغشاء الذي يتطور من filipodia في وقت مبكر لهياكل مثل العمود الفقري 3. على أساس هذا السلوك الديناميكي وغيرها من الخصائص، ويعتقد أن العمود الفقري شجيري لتوفير الركيزة التشريحية لتخزين الذاكرة ومتشابك 4،5 الإرسال.
نظرا عشره الدور الحاسم الذي شجيري العمود الفقري حجم وشكل وظيفة في متشابك، من المهم لقياس أبعادها بدقة. العمود الفقري تختلف من حوالي 200 إلى 2،000 نانومتر في طول ويمكن التعرف بسهولة عن طريق الليزر متحد البؤر المسح المجهري مضان. ومع ذلك، أبعاد العمود الفقري غيرها من طول وعادة ما تكون أقل من القرار النظم البصرية التقليدية '، ثابت نظريا بواسطة حيود نحو 200 نانومتر 6. حل هذه القوى غير كافية لتصوير التفاصيل الدقيقة، مثل عرض رقاب العمود الفقري ورؤساء. فقد تم تخصيص الكثير من العمل على حل هذه المشكلة وقدمت العديد من التقنيات الجديدة نسبيا المجهر فائقة القرار تقدما كبيرا. على وجه الخصوص، فمن الممكن لتحقيق القرار إلى أبعد من الحد الكلاسيكية دون تجاهل أي ضوء الانبعاثات باستخدام منظم أفقيا إضاءة المجهر (SIM) في واسعة المجال، مجهر غير متحد البؤر 7-10. باستخدام هذه التقنية في تركيبة مع غير الخط-تقنيات المجهر ص، فمن الممكن نظريا لتحسين القرار الوحشي المجهر الضوئي من قبل عامل غير محدود 11. ومع ذلك، في معظم الظروف التجريبية، SIM يسمح لتجاوز الحد القرار من قبل عامل من اثنين 1. تقنيات المجهر الضوئي فائقة الدقة أخرى مثل استنزاف الانبعاث المستحث (STED) المجهري 12 والصور تفعيل توطين المجهري (النخيل) 12 تم تطبيقها على التصوير من العمود الفقري شجيري. الأساليب القائمة على توطين مثل النخيل تتطلب أعدادا كبيرة جدا من الصور الخام لتحقيق فائقة الدقة، وبالتالي فهي محدودة في السرعة. من ناحية أخرى، يمكن تحقيق STED عالية السرعة التصوير، على الرغم من التهم الفوتون منخفضة نسبيا وحقول صغيرة للعرض، والتي قد لا يكون هذا هو الحال لSIM 13.
في هذه المقالة أن الهدف هو توفير بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الابتدائي تربيتها في المختبر </م> استخدام SIM. يتكون البروتوكول من مرحلتين مميزة: واحد الأولية تتكون من إنشاء وتطوير وترنسفكأيشن والمناعية من الفئران الثقافات الخلايا العصبية قرن آمون الابتدائية ومرحلة أواخر مخصص لأخذ عينات التصوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة يوصف بروتوكول عمل لصورة العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الابتدائي تربيتها في المختبر باستخدام SIM. في قرن آمون طريقة ثقافة العصبية الأولية هو التكيف للطريقة الأصلية التي وصفها Kaech وبانكر 18. الاختلافات الرئيسية هي استخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل عدد H64.09.016 منحة VIDI من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO) لCPF. CPF ممتن للدكتور سلفينا A. Fratantoni لها تعليقات وتصحيحات الحرجة على المخطوطة النهائية. معتمدة GMRDL / EMMM من مؤسسة تقنية STW الهولندية (12151 المشروع و11350)، والذي هو جزء من NWO، والذي يتم تمويله جزئيا من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية. نشكر كاثرين كيتس وبيتر Drent من نيكون الآلات أوروبا BV للحصول على المساعدة والدعم. HX كان مدعوما من الأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (منحة 11CDP10) وWT كان مدعوما من منحة المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية (منحة 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
