Визуализация дендритных шипиков крысы первичной нейронов гиппокампа с помощью структурированного подсветки микроскопия
Summary
В этой статье описывается рабочего протокола к фото дендритных шипиков от нейронов гиппокампа в пробирке с использованием структурированного подсветки микроскопия (SIM). Супер-разрешение микроскопии с использованием SIM предоставляет разрешение изображения существенно за световой дифракционного предела во всех трех пространственных измерениях, позволяя визуализацию отдельных дендритных шипиков с улучшенной подробно.
Abstract
Дендритные шипы выступы, возникшие в результате дендрита нейрона и представляют собой первичные постсинаптические целей возбуждающим сигналам в головном мозге. Технологические достижения определили эти структуры в качестве ключевых элементов в связи нейронов и синаптической пластичности. Количественный анализ позвоночника морфологии с использованием световой микроскопии остается существенной проблемой из-за технических ограничений, связанных с внутренней предела рефракции света. Дендритные шипы могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Однако измерение тонкие изменения в форме и размеру шипами трудно, потому что позвоночник размеры, отличные от длины, как правило, меньше, чем при обычном оптическом разрешении, установленного теоретического предела разрешения световой микроскопии в 200 нм.
Несколько современные методы суперразрешением были использованы для изображения клеточных структур, меньших 200 нм, в том числе дендритных шипиков. ТHESE методы основаны на классических операций дальнего поля и, следовательно, позволяют использовать существующие методы подготовки образца и имиджу за пределами поверхности образца. Описанный здесь является рабочим протокол применять суперразрешения структурированы освещения микроскопии (SIM) в визуализации дендритных шипиков в первичных гиппокампа культур нейронных. Возможные применения SIM пересекаются с конфокальной микроскопии. Тем не менее, две технологии представляют различные применения. SIM предлагает более высокую эффективную боковую разрешение, в то время как конфокальной микроскопии, в связи с использованием физического обскуры, приводит к усовершенствованию разрешения за счет удаления вне фокуса света. В этом протоколе, первичные нейроны культивировали на покровных стеклах с использованием стандартного протокола, трансфицированных ДНК-плазмиды, кодирующие флуоресцентные белки и отображаемого использованием SIM. Весь протокол, описанный здесь занимает около 2 недель, потому дендритных шипиков изображаются после 16-17 дней в пробирке, когдадендритных развития является оптимальным. После завершения протокола, дендритных шипиков может быть восстановлена в 3D от серии SIM стеки использованием специализированного программного обеспечения.
Introduction
Дендритных позвоночника небольшой выступ мембраны нейрона. Эта характеристика структура специализируется на обычно получают входной сигнал от одного синапса и представляет собой физическую площадь контакта между двумя нейронами. Большинство функционально зрелые дендритные шипики состоят из шарового наконечника, называемая головой и тонкой шеей, которая соединяет головку с дендритных вала. Тем не менее, шипы не являются статичными и активно двигаться и изменить свою морфологию непрерывно даже во взрослом мозге 2. В течение 2-недельного периода времени, крысы первичных культурах гиппокампа нейронов, полученные с конца эмбриона или раннем послеродовом время разработки сложных дендритных беседки с многочисленными мембранных выступов, которые развиваются с начала filipodia чтобы шиповидных структур 3. На основе этого динамического поведения и других характеристик, дендритных шипиков, как полагают, обеспечивают анатомическую субстрат для хранения памяти и синаптической 4,5 передачи.
Учитывая йэ важная роль, что дендритные размер позвоночника и форма уже в синаптической функции, важно измерять их параметры точно. Шипы варьировать от около 200 до 2000 нанометров в длину и могут быть легко идентифицированы с помощью конфокальной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, позвоночника размеры, отличные от длины, как правило, ниже разрешение обычных оптических систем ", теоретически, установленного дифракции около 200 нанометров 6. Эти разрешающей способности недостаточны для работы с изображениями тонкости, такие как ширина позвоночника шеи и головы. Большая работа была посвящена решить эту проблему и многие относительно новые методы микроскопии сверхвысокого разрешения предоставили существенный прогресс. В частности, можно добиться разрешения за пределы классического предела, не отказываясь любой свет выбросов с помощью боков структурированный освещения микроскопии (SIM) в широкоэкранном поля, не-конфокальной микроскопии 7-10. Используя эту технику в сочетании с не-Lineaметоды микроскопии г, теоретически можно улучшить боковую разрешение оптического микроскопа неограниченным коэффициентом 11. Тем не менее, в большинстве экспериментальных условиях, SIM позволяет превзойти предел разрешения в двух 1. Другие супер-разрешением методы оптической микроскопии, такие как Вынужденное истощение выбросов (STED) микроскопии 12 и фото-активации локализации микроскопии (PALM) 12 были применены к визуализации дендритных шипиков. Локализация на основе методов, таких как PALM требуют очень большого количества необработанных изображений для достижения супер-разрешения и поэтому ограничены в скорости. С другой стороны, STED может достичь высокую скорость обработки изображений, хотя при относительно низких фотоотсчетов и небольших полей зрения, которые не могут быть в случае SIM 13.
В этой статье цель заключается в предоставлении рабочего протокола для изображения дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа, культивируемых в пробирке </EM>, используя SIM-карту. Протокол состоит из двух различимых этапов: начальная одного состоящий из создания, развития, трансфекции и иммуногистохимии крысы первичных гиппокампа культур нейронных и поздней фазе, посвященной попробовать изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье рабочая протокол изображения дендритных шипиков от крыс первичных нейронов гиппокампа, культивируемых в лабораторных использованием SIM описывается. Основной метод гиппокампа нейрон культура как адаптация оригинального метода, описанного Kaech и Banker 18. Основные…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансироваться за счет VIDI числа грант H64.09.016 от Нидерландской организации научных исследований (NWO) к СПС. СПЛ благодарен доктору Сильвина А. Fratantoni за ее критические замечания и поправки на окончательный вариант рукописи. GMRDL / EMMM поддерживаются голландской технологии Foundation STW (проект 12151 и 11350), которая является частью НМП и которая частично финансируется Министерством экономики. Мы благодарим Кэтрин Китс и Питера Drent из Nikon Instruments Europe BV для помощи и поддержки. HX при поддержке Royal Dutch академии искусств и наук (грант 11CDP10) и WT выполнена при поддержке гранта Нидерландской организации научных исследований (грант 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
