פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מסלול היוביקוויטין-proteasome לפירוק חלבונים התפתחה כאחד מהמנגנונים החשובים ביותר לרגולציה של קשת רחבה של תפקודים תאיים כמעט בכל יצורי אוקריוטים. באופן ספציפי, בצמחים, במערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS) מסדירה פירוק חלבונים ותורמת באופן משמעותי לפיתוח של מגוון רחב של תהליכים, כולל תגובה חיסונית, פיתוח ומוות תאים מתוכנת. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שהגדלת פתוגנים רבים צמח, כגון Agrobacterium, לנצל את UPS המארח לזיהום יעיל, תוך שימת דגש על החשיבות של UPS באינטראקציות הצמח לפתוגן.
הספציפיות המצע של UPS מושגת על ידי האנזים יוביקוויטין E3 שפועל בתיאום עם E1 ו-E2 ligases לזהות ולסמן את מולקולות חלבון ספציפיות המיועדות לפירוק על ידי הצמדת אליהם שרשרות של מולקולות יוביקוויטין. סוג אחד של ligases E3 הוא SCF (Skp1 / Cחלבון מורכב Ullin / F-box), שדווקא מכיר במצעי UPS ומטרותיהם לubiquitination באמצעות מרכיב חלבון ה-F-התיבה שלו. כדי לחקור את התפקיד פוטנציאלי של UPS בתהליך ביולוגי של עניין, חשוב לתכנן assay פשוט ואמין לפירוק חלבונים בתיווך UPS. כאן, אנו מתארים assay אחד כזה באמצעות מערכת ללא תא צמח. assay זה יכול להיות מותאם למחקרים של התפקידים של פירוק חלבונים מווסת בתהליכים תאיים שונים, עם דגש מיוחד על אינטראקציות חלבון מצע F-box.
מבוא
המסלול הפרוטאזום ubiquitin/26S מתגלה כמנגנון נפוץ לבקרה של תגובות ביולוגיות שונות, כוללים תקנת תעתיק, התקדמות מחזור התא והולכים אותות, קולט למטה תקנה או אנדוציטוזה, בין השאר מעבד 1-4. במסלול זה, חלבון המטרה מתויג על ידי יוביקוויטין שאריות אשר מחוברות ראשונה באמצעות אג"ח thiolester לאנזים שמפעיל את היוביקוויטין E1 ולאחר מכן translocated לשאריות חומצת אמינו ציסטאין של אנזים היוביקוויטין-נטיית E2, סוף סוף, E2 אינטראקציה עם האנזים E3 יוביקוויטין , וכתוצאה מכך polyubiquitination של מצע החלבון. סופו של דבר, חלבוני polyubiquitinated מוכרים ומושפלים על ידי הפרוטאזום 26S. במנגנון זה, אנזים E3 מציין את המצע ומשמש כמרכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ביטוי חלבון
- בחירה של מערכת ביטוי
בחר במערכת, כלומר, וקטורים ושיטת הצגת וקטור, מתאימה ביותר לביטוי של החלבון של העניין באורגניזם / תא דגם הספציפי. שים לב כי assay שלנו דורש ביטוי של החלבונים שנבדקו בכמויות בקלות detectible, אשר מושגת על ידי מיטב שינוי זמני של מספר הגדול של תאים. בצמחים, למשל, זה הכי טוב מושגת באמצעות פלסמידים ינארי כוקטורי ביטוי וAgrobacterium כמערכת אספקה. - בנייה של וקטורי ביטוי בינארי
לשכפל את רצף הקידוד (ים) של החלבון (ים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1, שהותאם מזלצמן ואח'. 17, מדגים ניסויי נציג לצורך זיהוי של השפלה proteasomal במערכת ללא תא. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים יציבות של VIP1 חלבון הקשורות להגנת צמח על ידי חלבון ה-F-תיבת VBF דרך מסלול SCF VBF בנ benthamiana. VBF ארבידופסיס וחלבונים מתויגים-HA VIP1 (ר 'VIP1) היו coexpressed transiently, וחלבון תוכן HA-VIP1 בתוך תמציות של העלים להביע נותח על ידי מערבי סופג. ניתוח זה הראה כי כמויות VIP1 הופחתו .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
assay זה מסתמך על הביטוי של החלבונים שנבדקו ברקמות צמח, ולכן תהליך התדרדרות proteasomal הפוטנציאל ברור שמתרחש כבר בתוך רקמות החיות. אנו assay יציבות חלבון, לעומת זאת, רק בתמציות, בזמן אפס מדגם המשמש כנקודת התייחסות הראשונית. לפיכך, אנו מגדירים אותו כassay ללא תא.
אחד היבטים חשובים להצלחה של assay זה הוא הבחירה הנכונה של וקטור הביטוי שממנו החלבון (ים) נבדק יופק. אלא אם כן נוגדנים ספציפיים נגד החלבון נבדק זמינים, ז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
העבודה שהובילה לפרסום זה קיבלה מימון מתכנית מארי קירי COFUND "U-הניידות", cofinanced על ידי האוניברסיטה של מלאגה ותכנית האיחוד האירופי 7 מסגרת ה (FP7/2007-2013) תחת GA מס 246,550. העבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי מענקים מ-NIH, משרד החקלאות / NIFA, NSF, בארד, וBSF לVC
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת בדיקת חלבון | Bio-Rad | 500-0001 | |
| קוקטייל מעכב פרוטאינאז | סיגמא-אולדריץ | ' S8820 | |
| מערכת מיני-פרוטיאן | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-Dry Western Blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | מעבדת ICL | RHGT-45A-Z | |
| עיזים נגד ארנב IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT קרום העברת ניטרוצלולוז | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon מערבי כימי HRP מצע EMD | Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
מקורות
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
