Summary
פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.
Abstract
מסלול היוביקוויטין-proteasome לפירוק חלבונים התפתחה כאחד מהמנגנונים החשובים ביותר לרגולציה של קשת רחבה של תפקודים תאיים כמעט בכל יצורי אוקריוטים. באופן ספציפי, בצמחים, במערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS) מסדירה פירוק חלבונים ותורמת באופן משמעותי לפיתוח של מגוון רחב של תהליכים, כולל תגובה חיסונית, פיתוח ומוות תאים מתוכנת. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שהגדלת פתוגנים רבים צמח, כגון Agrobacterium, לנצל את UPS המארח לזיהום יעיל, תוך שימת דגש על החשיבות של UPS באינטראקציות הצמח לפתוגן.
הספציפיות המצע של UPS מושגת על ידי האנזים יוביקוויטין E3 שפועל בתיאום עם E1 ו-E2 ligases לזהות ולסמן את מולקולות חלבון ספציפיות המיועדות לפירוק על ידי הצמדת אליהם שרשרות של מולקולות יוביקוויטין. סוג אחד של ligases E3 הוא SCF (Skp1 / Cחלבון מורכב Ullin / F-box), שדווקא מכיר במצעי UPS ומטרותיהם לubiquitination באמצעות מרכיב חלבון ה-F-התיבה שלו. כדי לחקור את התפקיד פוטנציאלי של UPS בתהליך ביולוגי של עניין, חשוב לתכנן assay פשוט ואמין לפירוק חלבונים בתיווך UPS. כאן, אנו מתארים assay אחד כזה באמצעות מערכת ללא תא צמח. assay זה יכול להיות מותאם למחקרים של התפקידים של פירוק חלבונים מווסת בתהליכים תאיים שונים, עם דגש מיוחד על אינטראקציות חלבון מצע F-box.
Introduction
המסלול הפרוטאזום ubiquitin/26S מתגלה כמנגנון נפוץ לבקרה של תגובות ביולוגיות שונות, כוללים תקנת תעתיק, התקדמות מחזור התא והולכים אותות, קולט למטה תקנה או אנדוציטוזה, בין השאר מעבד 1-4. במסלול זה, חלבון המטרה מתויג על ידי יוביקוויטין שאריות אשר מחוברות ראשונה באמצעות אג"ח thiolester לאנזים שמפעיל את היוביקוויטין E1 ולאחר מכן translocated לשאריות חומצת אמינו ציסטאין של אנזים היוביקוויטין-נטיית E2, סוף סוף, E2 אינטראקציה עם האנזים E3 יוביקוויטין , וכתוצאה מכך polyubiquitination של מצע החלבון. סופו של דבר, חלבוני polyubiquitinated מוכרים ומושפלים על ידי הפרוטאזום 26S. במנגנון זה, אנזים E3 מציין את המצע ומשמש כמרכיב הרגולציה המרכזי של מערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS). ligases E3 יכול לפעול באופן עצמאי, כגון ligases תחום RING, או כחלק מSCF multisubunit (Sמורכב kp1/Cullin/F-box חלבון), כגון ligases תחום ה-F-התיבה. מסלולי השפלה proteasomal תיווך SCF מעורבים ברגולציה של שעתוק, מחזור תא, העברת אותות 5-10 ופונקציות רבות הסלולר גדולים אחרות.
חוץ מתפקידים אלה קריטיים בויסות תהליכים תאיים, UPS לוקח את הבמה המרכזית ביחסי גומלין הצמח לפתוגן רבים. לדוגמא, ראיות מצביעות על כך שהגדלת מספר פתוגנים צמח, כוללים tumefaciens Agrobacterium, מסתמכים על UPS המארח לכדי להקל על תהליך ההדבקה 11. Agrobacterium מעורר גידולי neoplastic על צמחים, המייצגים את המארחים הטבעיים שלה, וזה גם יכול להפוך מגוון רחב של אאוקריוטים אחרים, מפטריות 1,2 לתאים אנושיים 12,13. במהלך ההדבקה שלו, Agrobacterium מייצא אלמנט ה-DNA (T-DNA) וכמה ארסיות חלבונים (Vir) לתוך התא המארח 12-13. אחד מהחלבונים האלה הוא VirF, חלבון ה-F-התיבה הראשונה שנמצאכדי להיות מקודד על ידי הגנום פרוקריוטים 14. כחלק ממכלול SCF ubiquitin האנזים, VirF, וhomolog המארח הפונקציונלי שלה 15 VBF, להקל על זיהום Agrobacterium באמצעות פירוק חלבונים בתיווך UPS, אשר ככל הנראה מאפשר uncoating של T-DNA חיידקים הפולש מחלבונים החיידקים ומארח הנלווים לה, VirE2 וVIP1, בהתאמה 16,17. מעניין לציין, כי חלבוני ה-F-תיבה רבות, כולל VirF, הם מיסודם לא יציבים בשל proteolysis שלהם, שמתווך על ידי פעילות autoubiquitination 18,19 או על ידי ligases E3 אחר שחלבוני ה-F-תיבה עשויים לשמש כמצעי 20-23.
כאשר לומדים את פעילות הביוכימית של חלבוני ה-F-תיבה, ligases היוביקוויטין אחר, ו / או מצעים שלהם, זה יהיה מאוד שימושי כדי להעסיק assay פשוט ואמין לשפלת proteasomal. כאן אנו מתארים פרוטוקול אחד כזה לניתוח יציבות חלבון בתאללא מערכת. ב assay זה, היציבות של מצע UPS הוא ניתח בנוכחותו או היעדריו של אחד מהמרכיבים החיוניים של מסלול proteasomal השפלה, כגון חלבון ה-F-תיבה, במערכת ללא תא. באופן כללי, אנו מביעים את החלבון (ים) שנבדק ברקמות צמח, להכין תמציות תא ללא מרקמות אלה ולפקח על הכמויות של החלבון (ים) של עניין על ידי מערבי סופג. מנגנון UPS תלוי של פירוק חלבונים מודגם על ידי הכללתם של מעכבי proteasomal ספציפיים ו / או שימוש coexpression של צורה דומיננטית שלילית של מרכיב SCF, Cullin. הואיל ואנו להמחיש assay זה באמצעות השפלה proteasomal של חלבון ארבידופסיס VIP1 17 על ידי חלבון ה-F-תיבת 15 VBF, זה עשוי להיות מועסק על מנת לחקור את היציבות של כל מצעי proteasomal אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ביטוי חלבון
- בחירה של מערכת ביטוי
בחר במערכת, כלומר, וקטורים ושיטת הצגת וקטור, מתאימה ביותר לביטוי של החלבון של העניין באורגניזם / תא דגם הספציפי. שים לב כי assay שלנו דורש ביטוי של החלבונים שנבדקו בכמויות בקלות detectible, אשר מושגת על ידי מיטב שינוי זמני של מספר הגדול של תאים. בצמחים, למשל, זה הכי טוב מושגת באמצעות פלסמידים ינארי כוקטורי ביטוי וAgrobacterium כמערכת אספקה. - בנייה של וקטורי ביטוי בינארי
לשכפל את רצף הקידוד (ים) של החלבון (ים) של עניין לתוך וקטור ביטוי לבד או בשילוב של תרגום לתג epitope. שימוש וקטורים שמתאימים למערכת הביטוי שבחר ונהלי ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיים לשיבוט גנטי. למסירת גן בתיווך Agrobacterium, להעסיק וקטורים בינאריים ולהציג אותם, גם באמצעות standaפרוטוקולי rd, למתח Agrobacterium, כגון EHA105, לחיסון הבא של רקמות צמח. - בחירה של מיני צמחים
בחר את מיני צמחים שבו החלבון (ים) של העניין יבוא לידי ביטוי. שימו לב כי, בעוד שניתן להשתמש בם בכל מיני צמחים רגישים לשינוי גנטי בתיווך Agrobacterium, מיני הצמחים שלנו בחירה הוא ניקוטיאנה benthamiana, אשר גדל בקלות, רגיש מאוד לAgrobacterium, ויש לו עלים גדולים שהם מחוסן בקלות. - גידול צמחים
לגדל את הצמח אחת ל -4 עד 6 שבועות בסיר עם Pro-Mix BX בסיר (20 סנטימטר x 20 סנטימטר x 20 סנטימטר) בתנאי סביבה מבוקרים (למשל, תא צמיחה) של יום ארוך (כלומר, 16 שעות של 130 -150 ΜE m-2 אור S-1 ב23 מעלות צלזיוס וחשוכות שעות 8 ב20 מעלות צלזיוס) ו40-65% לחות יחסית.
1.5.2 לדשן מדי פעם עם מוצרים זמינים מסחרי לפי הוראות יצרן. ברגע שהצמח גדל, בחרמשאיר אותך עם הגודל של 50 מ"מ x 70 מ"מ או גדול יותר (מדידות אורך אלה אינן כוללות פטוטרת) עבור חיסון Agrobacterium. - חיסון עם Agrobacterium
לגדול זן Agrobacterium מחסה המבנה בינארי המבטא את החלבון (ים) נבדק מצעד 1.3 הלילה בשעה 28 מעלות צלזיוס במדיום YEP (peptone 1%, 1% תמצית שמרים, ו0.5% NaCl) בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה (למשל, 100 מ"ג / סטרפטומיצין L ו10 ריפאמפיצין מ"ג / ליטר עבור וקטורים מבוססי pPZP-RSC2 24-25).
1.6.2 צנטריפוגה התאים, resuspended לOD 600 = 0.5 במאגר הסתננות [10 מ"מ MgCl 2, 10 Mes מ"מ (pH 5.6), 100 acetosyringone מיקרומטר], ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. חדור בתרבות לצד abaxial של עלה, באמצעות מזרק מחטים 1 מ"ל; לציין כי העלים מחוסן באתרו, ואילו מצורף למפעל.
1.6.3 לאחר החדירה, מגדל את הצמח ל72 שעות תחת משטר אור 16 h & 130-150181 #; m-2 אור E S-1 ב23 ° כהה h C / 8 ב20 מעלות צלזיוס לפני הקציר. - יישום של מעכבי proteasomal
תומכים ברעיון כי החלבון (ים) שנבדק הוא מושפל על דרך מסלול proteasomal, השתמש MG132 מעכבי proteasomal הספציפי וlactacystin 28-29, שאמור להפחית או אפילו לחסום השפלה. ארבע שעות לפני קצירת (ראה שלב 2.1), לחדור לאזורי עלים מחוסן Agrobacterium עם 10 מיקרומטר MG132 (EMD Millipore) או 10 lactacystin מיקרומטר (סיגמא אולדריץ ') או מדומה לטפל עלה עם הממסים בהתאמה, כלומר, DMSO 0.1% או מים מזוקקים.
2. הכנת תמציות תא ללא
- קצירה ליף
קציר האזורים מחוסן של העלה, בדרך כלל CA. 200-400 מ"ג של משקל טרי, וטוחנים אותם לאבקה דקה בחנקן נוזלי. לחלופין, חרוז-לנצח את הרקמות, באמצעות כל חרוז-מקצף (למשל, Biospec) או amalgamator שיניים (למשל, TPC מתקדם טכנולוגיות) ישירות למאגר השפלה (ראה שלב 2.2). - הפקת חלבון
הכן כוללת תמצית חלבון על ידי הצבת רקמות קרקע ל500 μL של חיץ השפלה [50mm טריס-HCL (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 מ"מ MgCl 2, 5 מ"מ DTT, 5 מ"מ אדנוזין 5'-טריפוספט, ומעכבי פרוטאז 1x קוקטייל (סיגמא אולדריץ ')]. שים לב כי מעכבי פרוטאז הקוקטייל משפיע בעיקר על סרין, ציסטאין, אספרטית, וmetalloproteases ואינו מפריע לפרוטאז 26S. להבהיר את התמצית על ידי שתי centrifugations הרציף ב12,000 XG במשך 5 דקות. - תגובת פירוק חלבונים
העבר את הכמויות שווה של תמציות, בדרך כלל 20 μL, לmicrofuge צינורות דגירה אותם בטמפרטורת חדר להגדלת פרקי זמן. בדרך כלל, זמן מדגם אפס, ו5, 10, 15, 20, ו30 נקודות זמן דקות. לעצור תגובות על ידי רתחה בחיץ ג'ל מדגם SDS, ולנתח אותם על ידי מערבי סופג.
- ג'ל אלקטרופורזה
3.1.1 לפתור דגימות חלבון על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide וelectrotransfer החלבונים החליטו קרום ניטרוצלולוזה על פי הפרוטוקול הסטנדרטי 30.
3.1.2 קביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד (Bio-Rad), ולטעון 50-80 מיקרוגרם של חלבון בסך הכל לכל נתיב. ודא כי כל הדגימות נטענות באותה מידה. עבור פקדי טעינה, להשוות עוצמות של מיני חלבון נמצאים בכל מקום, כגון רשתות גדולות המשוערת RuBisCO אשר נודדות כלהקה גדולה עם ניידות electrophoretic יחסי של כ 50 kDa, הם יכולים להיות מזוהים על ג'לים המוכתם הכחול Coomassie או על Ponceau S-או ניאון SYPRO רובי מוכתם קרומי ניטרוצלולוזה. - חסימה
לחסום את הקרום עם 5% חלב דל שומן ב TBST (10 מ"מ טריס-HCl, 140 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) עבור h 1 בטמפרטורת חדר. נוגדן ראשוני
מדולל נוגדנים נגד epitope עיקריים ב1% חלב דל שומן ב TBST לריכוז המומלץ על ידי היצרן ודגירה עם הקרום החסום עבור h 1 בטמפרטורת חדר או ללילה ב 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. - שטיפה
יש לשטוף את הממברנה היא שטפה ב20 TBST מיליליטר במשך 15 דקות פעם אחת, ופעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. - נוגדנים משני
מדולל נוגדנים משני (למשל, IgG נגד ארנב) מצומד עם peroxidase סוס צנון (HRP) ב 1% חלב דל שומן ב TBST כפי שהומלץ על ידי היצרן ו דגירה עם הקרום עבור h 1 בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה. - איתור
יש לשטוף את הקרום שוב כפי שמתואר בשלב 3.4. לאחר השטיפה הסופית ב TBST, לדמיין את החלבונים של עניין עם מצע chemiluminescent HRP, לרוב באמצעות ערכת ECL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1, שהותאם מזלצמן ואח'. 17, מדגים ניסויי נציג לצורך זיהוי של השפלה proteasomal במערכת ללא תא. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים יציבות של VIP1 חלבון הקשורות להגנת צמח על ידי חלבון ה-F-תיבת VBF דרך מסלול SCF VBF בנ benthamiana. VBF ארבידופסיס וחלבונים מתויגים-HA VIP1 (ר 'VIP1) היו coexpressed transiently, וחלבון תוכן HA-VIP1 בתוך תמציות של העלים להביע נותח על ידי מערבי סופג. ניתוח זה הראה כי כמויות VIP1 הופחתו במידה משמעותית כאשר coexpressed עם VBF, אבל נותר יציב יחסית בהעדר coexpression VBF (איור 1 א). שים לב שירידה קלה בתוכן VIP1 ללא VBF יכולה להיות בגלל הרמה הנמוכה של פעילות VBF טבק אנדוגני. מנגנון השפלה proteasomal של יציבות VIP1 ידי VBF היה להסיק ממנה inhibition ידי MG132 (איור 1 א). כימות של התוצאות באיור 1A הפגינה (≥ 90 5% ±) VIP1 כמעט מוחלט על ידי VBF, שנחסם על ידי MG132 (איור 1). שים לב כי רמות מעט גבוהות יותר של VIP1 בנוכחות MG132 הסביר ביותר מוסבר על ידי עיכוב של פעילות VBF אנדוגני 17.
איור 1. VBF מקדם השפלה proteasomal של VIP1. HA-VIP1 התבטא לבד או coexpressed עם VBF בנ benthamiana עוזב. תמציות חלבון וכתוצאה מכך טופחו במשך תקופות זמן המצוינות ונותחו על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים נגד HA. הרשת הגדולה RuBisCO המשוער שימשה כבקרת טעינה (א '). Quantifieאות כתם המערבית ד באה לידי ביטוי כאחוז מהאות המתקבל בהעדר VBF בתחילת תקופת הדגירה. הנתונים מייצגים ערכים ממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים בחריגות שצוינו סטנדרטיות (ב '). נתון זה הותאם מ זלצמן ואח'. 17
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
assay זה מסתמך על הביטוי של החלבונים שנבדקו ברקמות צמח, ולכן תהליך התדרדרות proteasomal הפוטנציאל ברור שמתרחש כבר בתוך רקמות החיות. אנו assay יציבות חלבון, לעומת זאת, רק בתמציות, בזמן אפס מדגם המשמש כנקודת התייחסות הראשונית. לפיכך, אנו מגדירים אותו כassay ללא תא.
אחד היבטים חשובים להצלחה של assay זה הוא הבחירה הנכונה של וקטור הביטוי שממנו החלבון (ים) נבדק יופק. אלא אם כן נוגדנים ספציפיים נגד החלבון נבדק זמינים, זה צריך להיות לגילוי על ידי מערבי סופג מתויג epitope. החלבון מתויג צריך לבוא לידי ביטוי מוקטור בינארי Agrobacterium. בעוד שרבי וקטורים כאלה זמינים 26, אנו מציעים באמצעות וקטורים הנגזרים מהמערכת שלנו מודולרית PSAT פלסמיד 24, המאפשרת כניסה צעד אחד של קלטות ביטוי לפלסמידים ינארי pPZP-RCS224-25. יתרון נוסף של מערכת PSAT הוא שהיא מאפשרת ביטוי של גנים מרובים מאותו הווקטור 25, וזה שימושי במיוחד עבור ניסויים לassay כמה מצעי proteasomal או כדי לחקור את ההשפעות של interactors של המצע שנבדק, למשל coexpression של VirD5 Agrobacterium חלבון שמתקשר עם תוצאות VirF מצע proteasomal בהגנת VirF משפלת proteasomal 22. חשוב לציין, סדרת PSAT הרחבת של וקטור כבר כוללת וקטורים לאפיטופ תיוג 27. ללא קשר לאסטרטגית השיבוט בחרה, הרצף המקודד את החלבון מתויג epitope של עניין צריך להיות הציג בוקטור בינארי לביטוי לאחר מכן ברקמות צמח. בגלל assay זה משתמש בביטוי חולף, הווקטור בינארי אינו צריך להכיל סמני בחירה לשינוי יציב, אם כי הנוכחות שלהם היא לא מזיק ליעילות assay.
למרות coexpression של כמה חלבוני עניין הוא הטוב ביותר להשיג באמצעות וקטורי ביטוי multigene, יכול גם לעשות את זה על ידי שילוב של כמויות שווה ערך של תרבויות נוזלי של שניים או שלושה זני Agrobacterium, כל אחד מהם נושא את מבנה הבינארי נפרד.
עוד נקודה קריטית היא שבמקרים רבים, assay השפלה proteasomal כרוך ביטוי לא רק של מצע proteasomal, אלא גם ממרכיב של מסלול SCF. לדוגמא, המטרה של הניסוי עשויה להיות כדי לבדוק אם חלבון ה-F-תיבה מזהה ויעדים לשפלה מצע ספציפי. במקרה זה, מצע-מתויג epitope זה צריך להיות coexpressed עם חלבון ה-F-התיבה לא מתויג.
לניתוח מפורט יותר של הנתונים, היקף פירוק חלבונים ניתן לכמת בקלות על ידי מדידת עוצמתן היחסית של האותות המערביים uלשיר ImageJ התוכנה האחרונה (NIH) ביום 31. בעת ביצוע כימות כזה, חשוב לא ליותר לפתח כתמים המערביים כדי למנוע הרוויה אות. כימות הנתונים גם דורש כי כל הדגימות נטענות על ג'ל SDS-polyacrylamide באותה מידה ביחס לתכולת החלבון שלהם, כמו פירוק חלבונים בassay זה הוא זוהה על ידי ירידה באינטנסיביות של להקת החלבון המתאימה. זו מושגת על ידי קביעת תכולת החלבון של כל תמצית תא ועל ידי אימות עקב של העמסה שווה של כל מסלול (ראה שלב 3.1). יתר על כן, בכל ניסוי בזמן קורס נתון, צריכה להיגזר כל הדגימות מאותה אצווה של תמצית מסייע להבטיח טעינה שווה.
Assay התא ללא לשפלת proteasomal המתוארת כאן משתמש צמחים כמערכת ניסיונית. עם זאת, את אותו העיצוב ניסיוני יוכל לשמש עבור כל אורגניזם אחר. Assay גם ניתן להרחיב על ידי פירטאה התמקדות במסלול SCF. למשל, מנגנון SCF תלוי של פירוק חלבונים ניתן להדגים באמצעות טופס דומיננטי שלילי של CULLIN1 SCF הרכיב (CUL1 DN). באופן ספציפי, מוטציה של ארבידופסיס CUL1 עם שאריות חומצת אמינו שנמחקו בין עמדות 1 ו 420 הוכח אינטראקציה עם רכיב Skp1/ASK1 של מתחם SCF, אבל לא עם RBX1, המייצג את הליבה הקטליטית של 22 SCF. עיכוב או צמצום של השפלה המצע הבא coexpression של CUL1 DN מצביע על מעורבות של מסלול SCF.
assay שלנו מנצל חלבונים של עניין מתבטאים ברקמות צמח, בסביבה הטבעית שלהם. חלופה אחת לגישה זו היא לטהר את החלבונים רקומביננטיים, להוסיף אותם לתמציות צמחים, ופעל השפלה שלהם על ידי ניתוח מערבי 32. אנו לא ממליצים על טקטיקה זו כמתודולוגיה של ברירה כי חלבונים רקומביננטיים לא alwayזה משקף נאמנה את המאפיינים ביולוגיים המקוריים, עם זאת, אם הביטוי בPlanta הוא לא ריאלי, את השימוש בחלבונים רקומביננטיים בהחלט מהווה חלופה רבת ערך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
העבודה שהובילה לפרסום זה קיבלה מימון מתכנית מארי קירי COFUND "U-הניידות", cofinanced על ידי האוניברסיטה של מלאגה ותכנית האיחוד האירופי 7 מסגרת ה (FP7/2007-2013) תחת GA מס 246,550. העבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי מענקים מ-NIH, משרד החקלאות / NIFA, NSF, בארד, וBSF לVC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D.
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A.
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
