Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.
La vía de la ubiquitina-proteasoma para la degradación de proteínas se ha convertido en uno de los mecanismos más importantes para la regulación de una amplia gama de funciones celulares en prácticamente todos los organismos eucariotas. Específicamente, en las plantas, el sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regula la degradación de proteínas y contribuye significativamente al desarrollo de una amplia gama de procesos, incluyendo la respuesta inmune, desarrollo y muerte celular programada. Por otra parte, cada vez más evidencia sugiere que numerosos patógenos de las plantas, tales como Agrobacterium, explotan la acogida de UPS para la infección eficiente, haciendo hincapié en la importancia de la UPS en las interacciones planta-patógeno.
La especificidad de sustrato de la UPS se consigue mediante la ubiquitina ligasa E3 que actúa en concierto con la E1 y E2 ligasas para reconocer y marcar moléculas de proteínas específicas destinadas a la degradación por unir a ellos cadenas de moléculas de ubiquitina. Una clase de las ligasas E3 es el SCF (Skp1 / Cproteína ullin / F-box) compleja, que reconoce específicamente los sustratos de UPS y los dirige a través de su componente de ubiquitinación de proteínas F-box. Para investigar un posible papel de la UPS en un proceso biológico de interés, es importante para idear un ensayo simple y fiable para la degradación de proteínas mediada por UPS. Aquí, se describe uno de tales ensayo utilizando un sistema libre de células de la planta. Este ensayo se puede adaptar para el estudio de las funciones de la degradación de proteínas regulado en diversos procesos celulares, con un enfoque especial en los F-box interacciones proteína-sustrato.
La vía del proteasoma ubiquitin/26S está emergiendo como un mecanismo generalizado para el control de diversas reacciones biológicas, incluyendo la regulación transcripcional, la progresión del ciclo celular y la transducción de la señal, el receptor de baja regulación o endocitosis, entre otros procesos de 1-4. En esta vía, la proteína diana se marca por ubiquitina residuos que se unen primero a través de un enlace tioléster de enzima ubiquitina-activación de E1 y luego trasladadas a un residuo de aminoácido cisteína de la enzima ubiquitina-conjugación E2; finalmente, E2 interactúa con ubiquitina ligasa E3 , lo que resulta en polyubiquitination del sustrato proteína. En última instancia, las proteínas polyubiquitinated son reconocidos y degradados por el proteasoma 26S. En este mecanismo, la enzima E3 especifica el sustrato y actúa como el componente regulador clave del sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasas E3 pueden actuar independientemente, tales como ligasas de dominio ANILLO, o como parte de un SCF de múltiples subunidades (Skp1/Cullin/F-box proteína) compleja, como ligasas de dominio F-box. Vías de degradación proteasomal mediadas por SCF están involucrados en la regulación de la transcripción, el ciclo celular, la transducción de señal de 5-10 y muchas otras funciones celulares importantes.
Además de estos papeles críticos en la regulación de procesos celulares, UPS toma el escenario central en muchas de las interacciones planta-patógeno. Por ejemplo, el aumento de la evidencia sugiere que varios patógenos de plantas, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, se basan en la acogida de UPS para facilitar el proceso de infección 11. Agrobacterium provoca crecimientos neoplásicos en las plantas, que representan sus huéspedes naturales, y también puede transformar una amplia gama de otros eucariotas, a partir de hongos 1,2 a las células humanas 12,13. Durante su infección, de Agrobacterium exporta un elemento de ADN (ADN-T) y varios virulencia (Vir) las proteínas en la célula huésped 12-13. Una de estas proteínas es VirF, la primera proteína F-box encontradopara ser codificada por un genoma procariota 14. Como parte del complejo SCF ubiquitina ligasa, VirF, y su homólogo anfitrión funcional VBF 15, facilitar la infección de Agrobacterium a través de la degradación de proteínas mediada por la UPS, que presumiblemente facilita uncoating de la T-ADN bacteriano invasor de sus acompañan proteínas bacterianas y de acogida, VirE2 y VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muchas proteínas F-box, incluyendo VirF, son intrínsecamente inestables debido a su propia proteólisis, que está mediada por la actividad autoubiquitination 18,19 o por otras ligasas E3 para el que F-box proteínas pueden servir como sustratos 20-23.
Al estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas F-box, otras ligasas de ubiquitina, y / o sus sustratos, sería muy útil emplear un ensayo sencillo y fiable para la degradación proteasomal. Aquí se describe un protocolo de este tipo para el análisis de estabilidad de la proteína en una célulaSin sistema. En este ensayo, la estabilidad del sustrato de UPS se analiza en la presencia o ausencia de uno de los componentes esenciales de la vía de degradación proteasomal, tales como una proteína de la caja F, en un sistema libre de células. En general, expresamos la proteína (s) ensayados en los tejidos vegetales, preparar los extractos libres de células de estos tejidos y controlar las cantidades de la proteína (s) de interés por el Western Blot. El mecanismo de la UPS dependientes de la degradación de proteínas se demostró mediante la inclusión de inhibidores de proteasomal específicos y / o el uso de co-expresión de la forma dominante negativa de un componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustramos este ensayo usando la degradación proteasomal de la proteína de Arabidopsis VIP1 17 por la proteína F-box VBF 15, que se puede emplear para investigar la estabilidad de los otros sustratos proteasomal.
Este ensayo se basa en la expresión de las proteínas de la prueba en tejidos de la planta, por lo tanto, el potencial proceso de degradación proteasomal, obviamente, se produce ya dentro de los tejidos vivos. Nosotros ensayamos la desestabilización de proteínas, sin embargo, sólo en los extractos, con el tiempo de la muestra cero que sirve como el punto de referencia inicial. Por lo tanto, se define como un ensayo libre de células.
Un aspecto importante para el éxito de este ensayo e…
The authors have nothing to disclose.
El trabajo que lleva a esta publicación ha recibido financiación del programa Marie Curie COFUND "U-Mobility", cofinanciado por la Universidad de Málaga y el Programa de la Unión Europea el 7 º Programa Marco (FP7/2007-2013) bajo anestesia general N º 246550. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por subvenciones del NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD y BSF a VC
Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |