Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying
Summary
Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.
Abstract
Protein bozulması için ubikuitin-proteazom yolunun hemen hemen tüm ökaryotik organizmalarda hücresel fonksiyonların geniş bir yelpazede düzenlenmesi için en önemli mekanizmalardan biri olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle bitkilerde, ubiquitin/26S proteazom sistemi (UPS) protein bozulmasını düzenleyen ve bağışıklık tepkisi, geliştirme ve programlanmış hücre ölümü gibi işlemler geniş bir yelpazede, geliştirilmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, artan kanıtlar Agrobacterium gibi çok sayıda bitki patojenleri, bitki-patojen etkileşimleri UPS önemini vurgulayarak, etkin enfeksiyon konak UPS istismar olduğunu göstermektedir.
UPS alt-tabaka özgüllüğü, E1 ile uyum içinde hareket eder ve E2 bunlara ubiquitin moleküllerin zincirleri takılarak bozulması için hedeflenen spesifik protein moleküllerini tanıyan ve işaretlemek için ligaz E3 ligaz ubikitin ile elde edilir. E3 ligazlar bir sınıfı olan SCF (SKP1 / CÖzellikle UPS substratları tanır ve kendi F-box protein bileşeni aracılığıyla ubikuitinasyomınun için onları hedef Ullin / F-box protein) kompleksi. Ilgi konusu bir biyolojik süreç içinde UPS bir potansiyel rolünü araştırmak için, UPS aracılığında protein indirgenmesi için basit ve güvenilir bir tahlil hazırlamak için önemlidir. Burada, bir bitki hücresi serbest sistemi kullanılarak böyle bir tahlili tarif eder. Bu deney, F-box protein-substrat etkileşimleri ile ilgili özel bir odaklanarak, çeşitli hücresel süreçlerde düzenlenmiş protein degradasyon rolleri çalışmalar için uyarlanabilir.
Introduction
Ubiquitin/26S proteazomu yolu diğerleri arasında transkripsiyonel regülasyonu, hücre döngüsü ilerlemesi ve sinyal iletimi, reseptör down-regülasyonu veya endositoz, 1-4 işler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik reaksiyonlar, kontrolü için yaygın bir mekanizma olarak ortaya çıkmaktadır. Bu yol, hedef protein ilk ubikitin aktive edici enzim E1 için bir tiolester bağ üzerinden birleştirilmiş ve daha sonra ubikuitin konjugasyon enzim E2'nin bir sistein amino asit kalıntısına transloke tortuları ubikuitin ile etiketlenir, son olarak, E2, E3 ligaz ubiquitin ile etkileşime , protein alt-tabakanın polyubiquitination ile sonuçlanır. Sonuç olarak, proteinler polyubiquitinated 26S proteazomu tarafından tanınan ve parçalanırlar. Bu mekanizmada, E3 enzim substratı belirtir ve ubiquitin/26S proteazom sistemi (UPS) en önemli düzenleyici bir bileşeni olarak işlev görür. E3 ligaz gibi halka alanı ligazlar olarak, ya da bir multisubunit SCF (S parçası olarak, bağımsız bir şekilde hareket edebilirBöyle F-box etki ligazlara olarak kp1/Cullin/F-box protein) kompleksi. SCF aracılı proteozomal degradasyon yollarının transkripsiyon, hücre döngüsü, sinyal transdüksiyonu 5-10 ve birçok diğer önemli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynamaktadır.
Hücresel süreçlerin düzenlenmesinde bu kritik rolleri yanı sıra, UPS birçok bitki-patojen etkileşimleri merkezi sahne alıyor. Örneğin, artan kanıtlar Agrobacterium tumefaciens dahil olmak üzere birçok bitki patojenleri, enfeksiyon süreci 11 kolaylaştırmak için konakçı UPS güvenmek olduğunu göstermektedir. Agrobacterium doğal ana temsil eden bitkiler, neoplastik büyümeler ortaya çıkarır, ve aynı zamanda insan hücreleri 12,13 için mantar 1,2 dan, ökaryotlarda geniş bir yelpazede dönüştürebilir. Bu enfeksiyon esnasında, Agrobacterium konakçı hücre 12-13 bir DNA elemanı (T-DNA) ve çeşitli virülans (vir) proteinleri ihraç etmektedir. Bu proteinlerin biri VirF, bulunan ilk F-box proteindirBir prokaryotik genom 14 ile kodlanmış olması. SCF ubikuitin ligaz kompleksi, VirF ve onun fonksiyonel bir ev sahibi homolog VBF 15 bir parçası olarak, muhtemelen VirE2, ona eşlik eden bir bakteriyel ve konak proteinler istilacı bakteri T-DNA'nın integraz kolaylaştırır UPS-aracılı protein yıkımı, Agrobacterium ile enfeksiyon kolaylaştırmak VIP1 ve sırasıyla 16,17. İlginçtir, VirF dahil olmak üzere birçok F-box proteinler, nedeniyle autoubiquitination aktivite 18,19 veya F-box proteinler yüzeylerde 20-23 olarak hizmet olabilecek diğer E3 ligazlara aracılık kendi proteoliz, özünde kararsız.
F-box proteinler, diğer ligazlar ubikitin ve / veya alt-tabakalar arasında biyokimyasal aktivitelerini incelemek, bu proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir deney kullanılması çok yararlı olacaktır. Burada, bir hücrede protein stabilitesini analiz etmek için böyle bir protokol açıklar-Free sistemi. Bu deneyde, UPS substratın kararlılık, hücre içermeyen bir sistem içinde, böyle bir F-box proteini olarak proteozomal bozunum yolu, temel bileşenlerinden biri varlığında veya yokluğunda analiz edilir. Genel olarak, bu dokulardan hücresiz özleri hazırlamak ve western blotting ile ilgilenilen protein (ler) in miktarları, monitör bitki dokularında test edilen protein (ler) ifade eder. Protein degradasyon UPS-bağımlı mekanizma özel proteozomal inhibitörleri ve / veya bir bileşen SCF, cullin dominant-negatif bir form of yakımının birlikte kullanılarak dahil ile gösterilmiştir. Biz VBF 15 F-box proteini ile, Arabidopsis VIP1 17 protein proteozomal bozundurması kullanılarak, bu tahlili göz önüne alarak, bu da başka alt-tabakalar proteozomal stabilitesini incelemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deney, bitki dokularında test edilen proteinlerin ekspresyonu dayanır, böylece, potansiyel proteozomal bozulması işlemi belli canlı dokular içinde daha önce ortaya çıkar. Sıfır örnek başlangıç referans noktası olarak hizmet eden zaman, sadece ekstrelerinde ise, protein kararsız hale gelmelerine tahlil. Bu yüzden, bir hücre içermeyen tahlil olarak tanımlar.
Bu deneyde başarısı için önemli bir yönü, test edilen protein (ler) üretilecek olan ifade vektör?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayının önde gelen iş GA No 246550 altında Malaga Üniversitesi ve Avrupa Birliği 7. Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) mali katkısıyla Marie Curie COFUND programı "U-Mobility", fon aldı. Laboratuvarımızda çalışma VC NIH, USDA / Nifa, NSF, ozan ve BSF hibe tarafından desteklenmektedir
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
