Nanopodia - Dun, Fragile Membraan Projecties met rollen in Celmigratie en Intercellulaire Interacties
Summary
Nanopodia zijn dun maar kwetsbare membraan kanalen die reiken tot 100 urn van toonaangevende voor-of naloopas van een cel en voelen de cellulaire omgeving. Direct fixatie bij 37 ° C, zacht wassen, en het vermijden van organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton en hogere Triton X-100 concentraties nodig zijn om de cellulaire structuren te nemen.
Abstract
Hechtende cellen in kweek te houden een gepolariseerde staat om beweging en intercellulaire interacties ondersteunen. Nanopodia zijn dun, langwerpig, grotendeels F-actine-negatieve membraan projecties in endotheliale en kanker cellen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) immunofluorescentiekleuring. TM4SF1 clusters 100-300 micrometer diameter TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) die 3 tot maar liefst 14 individuele TM4SF1 moleculen. TMED intermitterend gerangschikt langs nanopodia op een regelmatige afstand van 1 tot 3 TMED per μ m en stevig verankeren nanopodia matrix. Hierdoor nanopodia meer dan 100 μ m loopt van de toonaangevende voor-of naloopas van gepolariseerd endotheliale of tumorcellen en veroorzaakt membraan resten achterblijven op matr worden achtergelatenix wanneer de cel zich verwijdert. TMED en nanopodia over het hoofd gezien vanwege hun extreme kwetsbaarheid en gevoeligheid voor temperatuur. Routine wassen en fixatie verstoren de structuur. Nanopodia bewaard door directe fixatie in paraformaldehyde (PFA) bij 37 ° C, gevolgd door korte blootstelling aan 0,01% Triton X-100 voor kleuring. Nanopodia nieuwe perspectieven te openen in de celbiologie: ze beloven om ons begrip van hoe cellen voelen hun omgeving vorm te geven, op te sporen en te identificeren andere cellen op een afstand, initiëren intercellulaire interacties op nauw contact, en van de signalering mechanismen die betrokken zijn bij beweging, proliferatie en cel -cel communicatie. De werkwijzen die zijn ontwikkeld voor het bestuderen TM4SF1 afgeleide nanopodia nuttig voor studies van nanopodia dat andere celtypes door tussenkomst van klassieke tetraspanins, met name het alom tot expressie CD9, CD81, en CD151 vormen.
Introduction
Tijdens polarisatie voor beweging, dierlijke cellen uit te breiden een verscheidenheid aan dynamische, membraan uitsteeksels uit hun oppervlakken, waaronder filopodia, lamellipodia, retractie vezels, en ruches 1. Recent toegevoegd aan deze lijst waren nanopodia, een nieuw erkende type dunne (100-300 micrometer in doorsnede), langwerpig (tot 50-100 micrometer lang) membraan projectie die membraan kanalen voor de uitbreiding van de F-actine structuren zoals filopodia bieden en terugtrekken vezels, en die vlek positief met TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) in gekweekte endotheliale cellen en tumorcellen 2,3.
TM4SF1 is een eiwit met tetraspanine-achtige topologie die oorspronkelijk bekend was als een tumorcel antigen 4 vóór de ontdekking dat het molecuul een endotheelcel biomarker die een essentiële rol in endotheliale celproliferatie en migratie 2,3 speelt. Immunofluorescentiekleuring bleek dat TM4SF1 is gelokaliseerd aan perinucLear blaasjes en het plasmamembraan en wordt verrijkt met TM 4SF1 e nriched micro d omains (TMED). TMED anker nanopodia naar matrix en aanwezig in een regelmatige afstand van elkaar gestreepte patroon van 1-3 TMED / um lengte van nanopodia. Nanopodia typisch verlengen van toonaangevende voorzijde een cel en naloopas tijdens cel polarisatie voor beweging. Vanwege de stevige hechtende aard van TMED, nanopodia zijn niet in staat om terug te trekken in de cel als het beweegt weg; verlaten nanopodia residuen dus sporen uit het pad van de cellulaire beweging. Nanopodia bieden membraan kanalen voor F-actine en uitschuiven, en zijn sites van intercellulaire interacties en communicatie 2,3. Deze kenmerken betekenen dat nanopodia een unieke gelegenheid om de onderliggende mechanismen van F-actine assemblage tijdens cellulaire polarisatie, cellulaire sensing van het milieu, de bepaling van het pad en de richting van de cel beweging, en intercellulaire interacties te bestuderen bieden eennd communicatie.
Wegens het zeer hydrofobe karakter van TMED en de dunne en fragiele membraneuze aard van nanopodia, speciale zorg moet worden genomen om TMED en nanopodia behouden. De vernietiging van nanopodia en verwijdering van TMED door gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken is een mogelijke reden waarom slechts drieënzestig publicaties zijn verschenen op TM4SF1 sinds de eerste ontdekking in 1986 1 en voor het volledige gebrek aan kennis van TM4SF1 verrijking in 100-300 urn microdomeinen op het celoppervlak tot het verslag van TM4SF1 in endotheelcellen in 2009 2.
Conventionele methoden immunokleuring algemeen organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton om cellen te repareren en te gebruiken 0,1% of hoger Triton X-100 concentratie cellen permeabilize 5. Studies beschreven uitgevoerd drie grote veranderingen in de conventionele werkwijze te openbaren TMED en nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA en zet cellen in een 3776, C incubator, (ii) zachtjes kamertemperatuur PBS wassen, en (iii) minder dan 0,03% Triton X-100 slechts kort cellen permeabilize vóór toevoeging van primair antilichaam, zoals Triton X-100 hoger dan 0,03% zullen halen TM4SF1.
Alle tetraspanins vormen microdomeinen op de celmembraan 6 en sommige colocalize met TMED in endotheliale cellen en tumorcellen 2,3. Zoals tetraspanins zoals CD9, CD81 en CD151 alomtegenwoordig worden uitgedrukt, kan de kleuringsprotocol hier beschreven worden uitgebreid tot veel verschillende soorten cellen die TM4SF1 missen voor de studies van nanopodia functie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia dun celmembraan kanalen die stevig aan matrix door TMED en kan meer dan 100 urn uitstrekken vanaf een mobiel gepolariseerde cel milieu voelen en intercellulaire interacties mediëren 2,3. Nanopodia houden zo stevig dat residuen achterblijven als de cel verwijdert zich matrix (figuren 1 en 2). Nanopodia dus kunnen we bestuderen hoe cellen voelen hun omgeving en bepalen het pad van de cel bewegen, en hoe genexpressie of behandeling met geneesmiddelen veranderingen bew…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen Dr Harold Dvorak voor nuttige discussies waaronder de suggestie om fixatie proberen in 37 ° C PFA. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie P01 CA92644 en door een contract van de National Foundation for Cancer Research.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
References
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
