Nanopodia - finas, Projeções frágil membrana com papéis em Movimento Celular e intercelulares Interações
Summary
Nanopodia são canais de membrana fina, mas frágeis, que se estendem até 100 mm de líder frente ou à direita traseira de um celular e sentir o ambiente celular. Fixação directa a 37 ° C, lavagem suave, e evitar os solventes orgânicos como o etanol, metanol, ou de acetona e de Triton X-100 a concentrações mais elevadas são necessárias para observar estas estruturas celulares.
Abstract
As células aderentes em cultura manter um estado polarizado para apoiar o movimento e interações intercelulares. Nanopodia são finas, alongadas, em grande parte de actina F-negativo-projeções de membrana em células endoteliais e de câncer que podem ser visualizadas através de TM4SF1 (Transmembrane-4-L-seis-família-1) técnica de imunofluorescência. Cachos TM4SF1 em 100-300 diâmetro mM TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) contendo 3 a até 14 individuais TM4SF1 moléculas. TMED estão dispostas de forma intermitente ao longo nanopodia com um espaçamento regular de 1 a 3 TMED por μ m e ancorar firmemente nanopodia a matriz. Isso permite nanopodia estender mais de 100 μ m do líder frente ou à direita traseira de células endoteliais ou tumorais polarizadas, e faz com que os resíduos de membrana para ser deixado para trás em matrix quando a célula move-se para longe. TMED e nanopodia ter sido ignorado por causa de sua extrema fragilidade e sensibilidade à temperatura. Lavagem de rotina e fixação romper a estrutura. Nanopodia são preservadas por meio da fixação directa de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C, seguida por uma breve exposição a 0,01% de Triton X-100 antes da coloração. Nanopodia abrir novas perspectivas na biologia de células: eles prometem para reformular a nossa compreensão de como as células perceber seu ambiente, detectar e identificar outras células à distância, iniciar interações intercelulares em contacto estreito, e dos mecanismos de sinalização envolvidos no movimento, proliferação e celular -celulares comunicações. Os métodos que são desenvolvidos para estudar nanopodia TM4SF1 derivados podem ser úteis para estudos de nanopodia que se formam em outros tipos de células através da agência de tetraspanins clássicos, nomeadamente a CD9 onipresente expressa, CD81 e CD151.
Introduction
Durante a polarização para o movimento, as células animais estender uma variedade de dinâmicas, saliências da membrana de suas superfícies, incluindo filopodia, lamellipodia, fibras de retração, e babados 1. Recentemente adicionado a esta lista foram nanopodia, um tipo recém-reconhecido de fina (100-300 m de diâmetro), a projeção da membrana alongada (até 50-100 mM de comprimento) que oferecem canais de membrana para a extensão das estruturas de F-actina como filopodia e fibra de retracção, e que coraram positivamente com TM4SF1 (Transmembrana-4-L e seis-família-1) em células endoteliais e de tumor de células cultivadas 2,3.
TM4SF1 é uma proteína com topologia tetraspaninas semelhante que foi originalmente conhecido como um antigénio das células tumorais antes de 4 a descoberta de que a molécula é um biomarcador de células endoteliais, que desempenha um papel essencial na proliferação de células endoteliais e migração de 2,3. Imunofluorescência revelou que TM4SF1 está localizada a perinucvesículas Lear e para a membrana plasmática, e é enriquecido em TM 4SF1 e nriched micro omains d (TMED). TMED âncora nanopodia à matriz e presente em um padrão em faixas regularmente espaçadas de 1-3 comprimento TMED / mM de nanopodia. Nanopodia normalmente se estendem desde principal frente de uma célula e à direita traseira durante a polarização celular para o movimento. Devido à natureza aderente firme de TMED, nanopodia são incapazes de retrair de volta para dentro da célula, uma vez que se move para longe; resíduos nanopodia abandonados traçar, assim, o caminho do movimento celular. Nanopodia fornecer canais de membrana para a extensão F-actina e retração, e são locais de interações intercelulares e comunicações 2,3. Essas características significam que nanopodia proporcionar uma oportunidade única de estudar os mecanismos subjacentes a montagem F-actina durante a polarização celular, sensor de celular do ambiente, a determinação do caminho e direção do movimento celular e interações intercelulares umnd comunicações.
Devido à natureza altamente hidrofóbico de TMED ea natureza membranoso fina e frágil de nanopodia, um cuidado especial deve ser tomado a fim de preservar TMED e nanopodia. A destruição de nanopodia e remoção de TMED por métodos comuns de laboratório é uma possível razão para que apenas sessenta e três publicações apareceram na TM4SF1 desde a sua primeira descoberta, em 1986, 1 e para a total falta de conhecimento de TM4SF1 enriquecimento em 100-300 mM microdomínios em superfície das células até que o relatório de TM4SF1 em células endoteliais em 2009 2.
Métodos convencionais vulgarmente imunocoloração utilizar solventes orgânicos como o etanol, metanol, acetona ou para fixar as células e utilizar de 0,1% ou mais elevada a concentração de Triton X-100 a permeabilizar as células 5. Estudos descritos aqui implementados três grandes mudanças para o método convencional para revelar TMED e nanopodia: (i) usar 37 ° C PFA 4% e corrigir as células em um 3776; incubadora C, (ii) aplicar suave temperatura ambiente de lavagem PBS, e (iii) utilizar a menos de 0,03% de Triton X-100 apenas brevemente para permeabilizar as células antes da adição do anticorpo primário, tal como Triton X-100 0,03% maior do que irá extrair TM4SF1.
Todos tetraspanins formar microdomínios sobre a membrana da célula 6 e alguns colocalize com TMED em endoteliais e células tumorais 2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 e são ubiquamente expressas, o protocolo de coloração descrito aqui pode ser estendida a muitos tipos de células diferentes que carecem TM4SF1 para os estudos de função nanopodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia são finos canais de membrana celular que ligam firmemente à matriz através TMED e pode se estender mais do que 100 mm a partir de uma célula móvel polarizada para sentir o ambiente e mediar interações intercelulares 2,3. Nanopodia aderir à matriz tão firmemente que os resíduos são deixados para trás, como os movimentos de células de distância (Figuras 1 e 2). Nanopodia assim nos permitem estudar como as células sentir seu ambiente e determinar o camin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos Dr. Harold Dvorak para discussões úteis, incluindo a sugestão de tentar fixação em 37 ° C PFA. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder P01 CA92644 e por um contrato da Fundação Nacional para Pesquisa do Câncer.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
References
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