Nanopodia - सेल आंदोलन और कहनेवाला बातचीत में भूमिकाओं के साथ पतली, नाजुक झिल्ली अनुमान
Summary
Nanopodia एक सेल के सामने आगे या पीछे पीछे से 100 माइक्रोन तक विस्तार और सेलुलर पर्यावरण भावना है कि पतली लेकिन नाजुक झिल्ली चैनल हैं. 37 डिग्री सेल्सियस, कोमल धोने, और इथेनॉल, मेथनॉल, या एसीटोन जैसे कार्बनिक विलायकों के परिहार पर और उच्च ट्राइटन X-100 सांद्रता का प्रत्यक्ष निर्धारण इन सेलुलर संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं.
Abstract
संस्कृति में पक्षपाती कोशिकाओं आंदोलन और कहनेवाला बातचीत का समर्थन करने के लिए एक polarized स्थिति बनाए रखने के. Nanopodia, पतली लम्बी, TM4SF1 (Transmembrane-4-एल छह परिवार -1) immunofluorescence धुंधला के माध्यम से देखे जा सकते हैं कि endothelial और कैंसर की कोशिकाओं में बड़े पैमाने पर एफ actin नकारात्मक झिल्ली अनुमानों हैं. 100-300 माइक्रोन व्यास TMED में TM4SF1 समूहों के रूप में कई के रूप में 14 व्यक्ति TM4SF1 अणुओं को 3 युक्त (टीएम 4SF1 ई माइक्रो डी omains nriched). TMED 1 μ मीटर प्रति TMED 3 को और मजबूती मैट्रिक्स को nanopodia लंगर की एक नियमित अंतराल पर nanopodia साथ रहकर व्यवस्था कर रहे हैं. इस polarized endothelial या ट्यूमर कोशिकाओं के सामने आगे या पीछे पीछे से 100 से अधिक μ मीटर का विस्तार करने nanopodia सक्षम बनाता है, और matr पर पीछे नहीं छोड़ा जा सकता झिल्ली अवशेषों का कारण बनता हैनौवीं सेल दूर ले जाता है. TMED और nanopodia क्योंकि अपने चरम कमजोरी और तापमान के प्रति संवेदनशीलता की अनदेखी की गई है. नियमित धोने और निर्धारण संरचना को बाधित. Nanopodia धुंधला से पहले 0.01% ट्राइटन X-100 के लिए संक्षिप्त जोखिम है, जिसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस paraformaldehyde (पीएफए) में प्रत्यक्ष निर्धारण द्वारा संरक्षित कर रहे हैं. कोशिका जीव विज्ञान में नया खा़का खोलने Nanopodia: वे पता लगाने और एक दूरी पर अन्य कोशिकाओं की पहचान, निकट संपर्क में कहनेवाला बातचीत आरंभ, और आंदोलन, प्रसार में शामिल संकेतन तंत्र की, कोशिकाओं अपने पर्यावरण समझ कैसे की हमारी समझ को नयी आकृति प्रदान करना, और सेल के लिए वादा सेल संचार. TM4SF1 व्युत्पन्न nanopodia के अध्ययन के लिए विकसित कर रहे हैं कि तरीकों क्लासिक tetraspanins, विशेष रूप से सर्वत्र व्यक्त CD9, CD81, और CD151 की एजेंसी के माध्यम से अन्य प्रकार की कोशिकाओं में है कि फार्म nanopodia की पढ़ाई के लिए उपयोगी हो सकता है.
Introduction
आंदोलन के लिए ध्रुवीकरण के दौरान, पशु कोशिकाओं filopodia, lamellipodia, त्याग फाइबर, और झमेलें 1 सहित उनके सतहों से गतिशील, झिल्ली protrusions की एक किस्म का विस्तार. हाल ही में इस सूची में जोड़ा nanopodia, पतली की एक नव मान्यता प्राप्त प्रकार (व्यास में 100-300 माइक्रोन), ऐसे filopodia के रूप में एफ actin संरचनाओं के विस्तार के लिए झिल्ली चैनलों प्रदान कि लम्बी (अप करने के लिए 50-100 मीटर लंबा) झिल्ली प्रक्षेपण थे और त्याग फाइबर, और उस दाग सकारात्मक TM4SF1 (Transmembrane-4-एल छह परिवार -1) सुसंस्कृत endothelial और ट्यूमर कोशिकाओं 2,3 में साथ.
TM4SF1 मूल रूप से अणु endothelial सेल प्रसार और प्रवास 2,3 में एक आवश्यक भूमिका निभाता है कि एक endothelial सेल biomarker है कि खोज से पहले एक ट्यूमर कोशिका प्रतिजन 4 के रूप में जाना जाता था कि tetraspanin तरह टोपोलॉजी के साथ एक प्रोटीन है. Immunofluorescence धुंधला TM4SF1 perinuc के लिए स्थानीय है कि पता चलालेअर vesicles और प्लाज्मा झिल्ली, और टीएम 4SF1 ई nriched सूक्ष्म डी omains (TMED) में समृद्ध है. TMED लंगर मैट्रिक्स nanopodia और nanopodia 1-3 TMED / माइक्रोन लम्बाई की एक नियमित अंतराल पर बंधी पैटर्न में मौजूद. Nanopodia आम तौर पर एक सेल के अग्रणी सामने से विस्तार करने और आंदोलन के लिए सेल ध्रुवीकरण दौरान पीछे अनुगामी. कारण TMED की फर्म पक्षपाती प्रकृति के nanopodia इसे दूर ले जाता है के रूप में सेल में वापस वापस लेना करने में असमर्थ हैं; परित्यक्त nanopodia अवशेषों इस प्रकार सेलुलर आंदोलन के रास्ते बाहर का पता लगा. एफ actin विस्तार और त्याग के लिए झिल्ली चैनलों प्रदान करते हैं, और कहनेवाला बातचीत और संचार 2,3 की साइटों रहे हैं Nanopodia. इन विशेषताओं सेलुलर ध्रुवीकरण, पर्यावरण के सेलुलर संवेदन, सेल आंदोलन की राह और दिशा के निर्धारण, और कहनेवाला बातचीत के दौरान एफ actin विधानसभा अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान nanopodia का मतलब है कि एकएन डी संचार.
कारण TMED की अत्यधिक हाइड्रोफोबिक प्रकृति और nanopodia की पतली और नाजुक झिल्लीदार प्रकृति को, विशेष देखभाल TMED और nanopodia को संरक्षित करने के क्रम में लिया जाना चाहिए. nanopodia और आम प्रयोगशाला तरीकों से TMED को हटाने का विनाश ही तिरेसठ प्रकाशनों 1986 1 में अपनी पहली खोज के बाद से और पर 100-300 माइक्रोन microdomains में TM4SF1 संवर्धन के ज्ञान का पूर्ण अभाव के लिए TM4SF1 पर दिखाई दिया है क्यों एक संभावित कारण यह है कोशिका की सतह 2009 2 में endothelial कोशिकाओं में TM4SF1 की रिपोर्ट जब तक.
परम्परागत immunostaining तरीकों सामान्यतः कोशिकाओं को ठीक करने और कोशिकाओं 5 permeabilize को 0.1% या अधिक ट्राइटन X-100 एकाग्रता का उपयोग करने के लिए इथेनॉल, मेथनॉल, या एसीटोन जैसे कार्बनिक विलायकों का उपयोग करें. (मैं) 37 डिग्री सेल्सियस 4% पीएफए का उपयोग करें और एक 37 में कोशिकाओं को ठीक: यहां वर्णित अध्ययन TMED और nanopodia प्रकट करने के लिए पारंपरिक विधि के लिए तीन बड़े बदलाव लागू किया76, सी इनक्यूबेटर, (द्वितीय) कोमल कमरे के तापमान पीबीएस धोने लागू होते हैं, और (iii) ट्राइटन X-100 ट्राइटन X-100 0.03% की तुलना में अधिक निकालने के रूप में, प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा पहले कोशिकाओं permeabilize करने के लिए केवल कुछ समय कम से कम 0.03% का उपयोग TM4SF1.
सभी tetraspanins कोशिका झिल्ली 6 पर microdomains फार्म और कुछ endothelial और ट्यूमर कोशिकाओं 2,3 में TMED साथ colocalize. CD9, CD81, और CD151 तरह tetraspanins सर्वत्र व्यक्त कर रहे हैं, यहाँ वर्णित धुंधला प्रोटोकॉल nanopodia समारोह के अध्ययन के लिए TM4SF1 कमी है कि कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं को बढ़ाया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nanopodia मजबूती TMED के माध्यम से मैट्रिक्स को देते हैं और पर्यावरण भावना और कहनेवाला बातचीत 2,3 मध्यस्थता करने के लिए एक polarized मोबाइल सेल से 100 से अधिक माइक्रोन विस्तार कर सकते हैं कि पतली सेलुलर झिल्ली चैनल ह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम 37 डिग्री सेल्सियस पीएफए में नियतन की कोशिश करने का सुझाव सहित उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ. हेरोल्ड ड्वोरक को स्वीकार करते हैं. इस काम एनआईएच अनुदान P01 CA92644 द्वारा और कैंसर अनुसंधान के लिए नेशनल फाउंडेशन से एक अनुबंध द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| glass discs | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12-mm diameter |
| glass jar | Fisher Scientific | 02-912-310 | Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz. |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides |
| 50-ml falcon tube | BD Falcon | 352070 | 50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile. |
| 15-ml falcon tube with Styrofoam rack | Corning | 430790 | Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes |
| Sharp forceps | Fisher Scientific | 13-812-42 | Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| 24-well cell culture plate | BD Bioscience | 353047 | 24-well Cell Culture Plate |
| 150-mm cell culture plate | BD Bioscience | 353025 | 150-mm cell culture plate |
| 19G 1 ½ syringe needle | BD Bioscience | 309635 | 19G 1 ½ |
| Name of Reagent | |||
| ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon's Pure Ethanol 200 Proof |
| collagen solution | BD Bioscience | 354249 | Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg |
| trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% Trypsin-EDTA 1X |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate |
| 10X PBS | Affymetrix | 75889 5 LT | PBS, 10X Solution, pH 7.4 |
| PFA (paraformaldehyde) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4% in PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | Fetal Bovine Serum |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%. |
| mouse anti-human TM4SF1 antibody | Millipore | MAB3127 | Epitope is located in extracellular domain |
| mouse anti-human CD9 antibody | BD Bioscience | 555370 | Epitope is located in extracellular domain |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | Rhodamine-conjugated Phalloidin |
| anti-fade mounting media | Life Technologies | P-36931 | ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI |
| Buffers and solutions | |||
| 70% ethanol | 17.5 ml of ethanol (200 proof) 7.5 ml of double deionized water |
||
| 10X PBS (make 200 ml) | |||
| 20 ml of 10X PBS | |||
| 180 ml of double deionized water | |||
| 20% Triton X-100 (make 20 ml) | |||
| 4 ml | |||
| 16 ml double deionized water | |||
| 4% NaN3 (make 25 ml) | |||
| 1 g of NaN3 | |||
| 25 ml of double deionized water | |||
| 50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml) | |||
| Make stock soln. of 50 μg/ml (50 ml) | |||
| 830 μl of Collage I (3 mg) | |||
| 50 ml PBS | |||
| ICC Blocking Buffer (50 ml) | |||
| 49 ml PBS | |||
| 2% FBS (add 1 ml) | |||
| 0.04% NaN3 (add 100 μl of 4% NaN3) | |||
| ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml) | |||
| 50 ml of ICC Blocking Buffer | |||
| 25 μl of 20% Triton X-100 | |||
| Name of Cell | |||
| HUVEC | Lonza | C2517A | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7 |
| Name of Equipment | |||
| cell culture hood | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET |
| 37 °C, 5% CO2 cell culture incubator | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator |
| heating pad | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5×28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y) |
| centrifuge | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
References
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