A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

Summary

أسكوربات يلعب العديد من الأدوار الهامة في عملية الأيض الخلوية، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. نحن هنا وصف-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة لتحديد كلا أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

Abstract

فيتامين C (أسكوربات) يلعب دورا هاما في العديد من الأيض الخلوي، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. على سبيل المثال، داخل الدماغ، أسكوربات يتصرف بطريقة اعصاب وneuromodulatory التي تنطوي أسكوربات ركوب الدراجات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية vicinal – وهي العلاقة التي يبدو أن تكون حاسمة لأسكوربات الدماغ التوازن. بالإضافة إلى ذلك، والأدلة الناشئة تشير بقوة إلى أن أسكوربات دورا توسع كبير في تنظيم استقلاب الحديد الخلوية والنظامية مما هو معترف بها تقليديا. الاعتراف المتزايد بدور لا يتجزأ من أسكوربات في الفيزيولوجيا الخلوية والعضوي الطبيعي وحررت تطالب مجموعة من المتوسطة الإنتاجية وذات حساسية عالية التقنيات التحليلية التي يمكن تنفيذها دون الحاجة إلى معدات متخصصة مكلفة للغاية. هنا نقدم تعليمات صريحة ل-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة نسبيا لتحديد بوال أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

Introduction

كان اكتشاف الطبيعة الكيميائية للحمض الاسكوربيك (فيتامين C)، وتحديد على أنه "عامل مكافحة حفري" يسعى منذ فترة طويلة، من قبل ألبرت زينت-جيورجي وغيرهم في الأبحاث المنشورة 1928-1934 ¹ الأحداث البارزة في التاريخ الكيمياء الحيوية. في الواقع، ساهمت هذه الاكتشافات إلى زينت جيورجي-حصوله على جائزة نوبل في الفسيولوجيا أو الطب عام 1937. جناح الآخذة في التوسع من أدوار لأسكوربات في علم وظائف الأعضاء الحيوانية والنباتية، وكذلك صحة الإنسان، لا تزال نشطة من الموضوعات العلمية التحقيق والجدل.

L-أسكوربات هو اختزال الفسيولوجية وفيرة وانزيم العامل المساعد في نظم الثدييات، وتساهم في العديد من التفاعلات الإنزيمية محددة جيدا تنطوي على الهيدروكسيل والكولاجين، والكارنيتين بافراز الحيوي، والتمثيل الغذائي التيروزين وهرمون الببتيد amidation ^2. يثير الاهتمام والفضول، evide تصاعديوحي بأن الامتحانات التنافسية الوطنية أسكوربات يلعب دورا في تحفيز dioxygenases التي تعتمد على الحديد الأخرى، مثل prolyl وasparaginyl hydroxylases المشاركة في الهيدروكسيل واستهداف عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs) 1α و2α ^3. يقترح تقرير حديث أن أسكوربات يلعب دورا في نضوج الخلايا التائية من خلال لونين تؤثر نزع الميثيل عبر نشاطها في تحفيز hydroxylases النووية، Jumonji C (JmjC) البروتينات المجال؛ وهذه الأخيرة التي يبدو أنها تتطلب أسكوربات عن النشاط الكامل ^4. في الواقع، يبدو أن التحفيز هذه الانزيمات التي كتبها أسكوربات أن يحدث من خلال آلية مماثلة إلى التحفيز من قبل أسكوربات من مؤسسة الحرمين والكولاجين hydroxylases. من بين الآثار الكلاسيكية الأخرى، أسكوربات يساهم بشكل كبير في مضادة الأكسدة الخلوية وكسر سلسلة زبال الراديكالية للذوبان في الماء ⁽⁵⁾ وإلى إعادة تدوير غشاء البلازما α توكوفيرول (فيتامين E) عن طريق الحد من α-tocopheroxyl جذرية ^6، ثhich المهم في حماية الغشاء ضد بيروكسيد الدهون ^7. الأهم من ذلك، على الرغم من أن معظم الثدييات قادرة على دي نوفو توليف كبدي من أسكوربات من مد الجلوكوز، القرود العليا، خنازير غينيا وبعض الخفافيش تعتمد على المصادر الغذائية من فيتامين ^8. وهذا يرجع إلى تثبيط الجين GULO، وorthologues منها في الثدييات تتأثر ترميز الانزيم، γ-gulono-اكتون أوكسيديز ^9-13. مطلوب هذا الانزيم للتفاعل النهائي في أسكوربات الحيوي من الجلوكوز ^13.

بعد امتصاص بوساطة نقل من تجويف الأمعاء في البشر، ويتم توزيع أسكوربات في جميع أنحاء الجسم عن طريق الدورة الدموية. وعادة ما يتم العثور على الفيتامين في شكله انخفاض في تركيزات millimolar داخل الخلية (مع استثناء ملحوظ من الكريات الحمراء في تركيزات التي عادة ما تكون مماثلة لتركيز البلازما السائدة)، واضرب في مكروموليentrations (على سبيل المثال 50-200 ميكرومتر) في معظم سوائل خارج الخلية ^14،15.

في ظل الظروف الفسيولوجية، أسكوربات عادة تخضع لعملية الأكسدة عكسها إلكترون واحد إلى اسكوربيل الجذور الحرة (AFR؛ المعروف أيضا باسم monodehydroascorbate أو semidehydroascorbate). في حين أن AFR هو مستقر نسبيا الراديكالية ^16، في غياب السريع إلكترون واحد للحد من الأنزيمية عودتها الى أسكوربات، يمكن أن اثنين AFRs تعزيز dismutate إلى أسكوربات واحد واحد dehydroascorbate (DHA) ^9،13،17. في المناطق الداخلية من الخلية، وهما الإلكترون الأكسدة نتاج أسكوربات، DHA، ويمكن تخفيض بسرعة العودة إلى أسكوربات بواسطة الجلوتاثيون وNAD (P) الأنزيمية H-تعتمد وردود الفعل غير الأنزيمية ^13.

في حين أنه من المقبول أن كلاسيكي دورا هاما فقط أسكوربات في استقلاب الحديد هو تحفيز امتصاص الغذائية من الحديد غير الهيم ^18، نحن وآخرون قدموا الأدلة قمما يشير إلى أن trongly إستعمال أسكوربات يلعب دورا توسع كبير في عملية التمثيل الغذائي لهذا المعدن. الأولى، أسكوربات التي يتم تحريرها من قبل خلايا أسكوربات تزخر يبدو أن تلعب دورا هاما في تحوير امتصاص الحديد غير ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا ^19،20، والأدلة الأخيرة تشير إلى أن أسكوربات جدا أيضا ينظم امتصاص الحديد ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا ^21، وهذه الأخيرة التي يناظر الفسيولوجية ممر رئيسي لامتصاص الحديد ^22.

أسكوربات أمر ضروري لوظيفة عادية في الجهاز العصبي المركزي الثدييات ^23،24. جنبا إلى جنب مع القشرة الكظرية والغدة النخامية، الغدة الصعترية، الشبكية والجسم الأصفر، والدماغ يحتوي على تركيزات عالية من أسكوربات نسبة إلى أنسجة الجسم الأخرى ^23،25-27. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أن تعرض كل من الخلايا النجمية ^28،29 والعصبية التي تشبه الخلايا خلايا ³⁰ إلى الغلوتامات لتؤدي إلى الإفراج عن أسكوربات في الفضاء خارج الخلية، حيث ascorbatويعتقد الإلكترونية للمساعدة في حماية الخلايا العصبية التي يسببها ضد الغلوتامات العصبية العجز ^31. في حين أن الآلية الدقيقة التي يسببها الغلوتامات الإفراج أسكوربات من الخلايا النجمية غير معروف، وقدمنا ​​مؤخرا أدلة تشير إلى تورط خلية التورم الناجم عن امتصاص الغلوتامات من الغلوتامات نجمية ونقل اسبارتاتي (GLAST؛ المعروف أيضا الأحماض الأمينية مثير نقل الإسوي 1 [EAAT1 ] في البشر) ويترتب على ذلك تفعيل osmolyte وأنيون قنوات الحساسة الحجم (VSOACs) التي هي قابلة للاختراق لالأنيونات العضوية الصغيرة مثل أسكوربات ^32. تبقى الهويات الجزيئية للقنوات غشاء البلازما المشاركة في تشكيل VSOAC الكشف عن هويته ^33،34.

على الرغم من أن وضعت العديد من فحوصات لتحديد أسكوربات في العينات البيولوجية، والتي تشمل الطيف، وفلوروميتريك الكروماتوغرافي المقايسات ^35،36، هناك الكثير من التباين في خصوصية وحساسية، interferencه من الملوثات الكيميائية، ومجموعة خطية فعالية واستقرار الحليلة نقطة النهاية. بالإضافة إلى ذلك، عوامل الأخرى التي تؤثر على اختيار الاختبار هي سرعة، وسهولة الاستخدام والوصول إلى المعدات المتخصصة نسبيا مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) الجهاز.

نحن هنا تقديم مقايسة اللونية صفيحة ميكروسكوبية بسيطة ومحددة للغاية لتحديد أسكوربات الخلايا في الخلايا المستزرعة، فضلا عن فحص منفصل لتحديد أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة. يهدف الفحص الأخير للالتفاف على مشكلة التقليل من الإفراج أسكوربات من الخلايا نظرا لسرعة إعادة امتصاص أسكوربات صدر عن نقل أسكوربات التي تعتمد على الصوديوم (SVCTs). على الرغم من أن كل من هذه الأساليب التي ظهرت في بعض منشوراتنا السابقة ^{19،20،32،37،38،} يوفر هذا المخطوط مجموعة واضحة من التعليمات والمبادئ التوجيهية للتنفيذ على نحو فعال.

Protocol

1. تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة زراعة الخلايا والحصاد تنمو التعليق (مثل ابيضاض الدم الاحمراري الإنسان، K562) أو الخلايا الملتصقة (مثل</…

Representative Results

تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة تعليق في مقايسة الأولى (الشكل 1)، يتم تحديد أسكوربات داخل الخلايا، وبعد أسكوربات محددة (أي AO-الحساسة) الحد من فيري سيانيد لفيروسيانيد، وذلك باستخدام تقرير حساسة للغاية …

Discussion

في هذه الورقة نقدم اثنين السريع ومحددة وحساسة نسبيا المقايسات صفيحة ميكروسكوبية اللونية لتحديد أسكوربات المستمدة من المقصورات داخل وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة. المقايسات يمكن أن تكتمل مع إمكانية الوصول إلى المعدات المختبرية القياسية والكواشف. كاشف فقط تكلف?…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate