배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석

Summary

아스 코르 빈산은 최근 몇 년 동안 빛을 온 많은 중, 세포 대사에 많은 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 중간 처리, 세포 배양 모두 내 및 세포 외 아스코르브 산염의 결정에 대한 구체적인 저렴 마이크로 분석을 설명합니다.

Abstract

비타민 C (아스 코르 빈산)는 만 최근 몇 년 동안 빛을 온 많은 중 세포 대사에서 많은 중요한 역할을한다. 뇌 아스 코르 빈산의 항상성에 중요한 것으로 보인다 관계 – 예를 들어, 뇌 내에서, 아스코르브 산염은 뉴런과의 인접한 성상 세포 사이의 아스 코르 빈산 순환을 포함하는 신경과 neuromodulatory 방식으로 작동합니다. 또한, 새로운 증거가 강력하게 아스코르브 산염은 고전적인 인식되는 것보다 세포 및 조직 철의 신진 대사를 조절에 크게 확장 된 역할을하는 것이 좋습니다. 정상 및 자유화 세포 및 유기체 생리학 아스코르브의 필수적인 역할의 증가 인식은 매우 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 실행될 수있는 매체 처리량 및 고감도 분석 방법의 범위를 요구한다. 여기에서 우리는 중간 처리량을 명시 적으로 지시, 보의 결정에 대한 구체적이고 상대적으로 저렴한 마이크로 분석을 제공세포 배양에서 일 내 및 세포 외 아스 코르 빈산.

Introduction

1928 년에서 1934 년 ^1에 게시 된 신문에 아스 코르 빈산 (비타민 C), 그리고 염원 알버트 Szent-Györgyi로 "반 괴혈병 인자", 및 다른 사람과 같은 그 식별의 화학적 특성의 발견은 역사에서 획기적인 사건이었다 생화학. 사실, 이러한 발견은, Szent-Györgyi 1937 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수여된다. 동물과 식물 생리학 아스 코르 빈산의 역할의 끊임없이 확장 제품군뿐만 아니라 인간의 건강에 기여 활성 과학의 주제로 계속 조사와 논쟁.

L-아스 코르 빈산 풍부한 생리 환원제와 포유류의 시스템에서 보조 인자 (cofactor) 효소, 콜라겐 수산화, 카르니틴과 노르 에피네프린 생합성, 티로신 대사 및 펩타이드 호르몬 아미드 ^2를 포함하는 다수의 잘 정의 된 효소 반응에 기여한다. 흥미롭게도, 설치 evide후부는 아스 코르 베이트는 수산화 관련된 프 롤릴와 아스 파라 hydroxylases 다른 철에 의존 dioxygenases을 자극하고, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 1α 및 2α ³ 대상의 역할을하는 것이 좋습니다. 최근 보고서는 아스 코르 빈산 핵 hydroxylases, 몬지 C (JmjC) 도메인 단백질을 자극에서의 활동을 통해 크로 마틴의 탈 메틸화에 영향을 미치는을 통해 T-세포 성숙에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다; 후자의 전체 활동 ⁴ 아스 코르 빈산을 필요로 나타납니다. 실제로, 아스 코르 빈산에 의해 이러한 효소의 자극은 HIF 콜라겐 hydroxylases의 아스 코르 빈산에 의해 자극과 유사한 메커니즘에 의해 발생하는 것으로 나타납니다. 다른 고전적인 효과 중, 아스 코르 빈산 수용성 연쇄적인 라디칼 스 캐빈 저 ⁵ 셀룰러 항산화와 세포막의 재활용에 크게 기여 α-토코페롤 W, ⁶ α-토코페롤의 급진적 인 감소를 통해 (비타민 E)HICH는 막 지질 과산화 ^7에 대해 보호하는 것이 중요합니다. 대부분의 포유류는 D-포도당 아스 코르 빈산의 드 노보 간 합성 할 수 있지만 중요한 것은, 높은 영장류, 기니아 피그 및 일부 박쥐 비타민 ^8의식이 소스에 따라 달라집니다. 이 GULO 유전자의 불 활성화로 인해 영향을받지 포유 동물에서의 orthologues ^9-13 산화 효소 효소, γ-굴로-락톤을 인코딩합니다. 이 효소는 포도당 ¹³ 아스 코르 빈산 생합성의 최종 반응이 필요합니다.

인간의 창자 루멘에서 수송 매개 흡수 후, 아스 코르 베이트는 순환 시스템에 의해 몸 전체에 배포됩니다. 비타민은 일반적으로 (농도가 일반적으로 통용 혈장 농도와 유사하다하는 적혈구의 주목할만한 예외) 세포 내 밀리몰 농도에서와 마이크로 몰 진한에서 자사의 감소 형태로 발견대부분의 세포 외 체액 ^{(14, 15)에} entrations (예를 들면 50 ~ 200 μM).

생리적 조건 하에서, 아스 코르 베이트는 일반적 아스코 자유 라디칼에 가역성 원 전자 산화를 겪는다 (AFR '또한 monodehydroascorbate 또는 semidehydroascorbate라고도 함). AFR 다시 아스코르브에 급속한 한 전자 환원 효소의 부재, 상대적으로 안정 라디칼 ^{(16)이지만,이} AFRs 한 아스코르브 하나 dehydroascorbate (DHA) ^9,13,17에 dismutate을 발전 할 수있다. 셀의 내부에, 아스 코르 베이트, DHA의 2 전자 산화 생성물은 급속 글루타티온 및 NAD (P) H-의존적 효소 적 및 비 효소 반응 ^(13)에 의해 확대 아스코르브로 감소 될 수있다.

이 고전 철 대사에 아스 코르 빈산의 유일한 중요한 역할이 아닌 헴 철 ^{(18)의식이} 흡수를 자극하는 것을 허용하는 동안, 우리와 다른 증거들을 제공 한trongly 그 아스 코르 빈산을 제안하는 것은이 금속의 대사에 크게 확장 된 역할을한다. 첫째, 아스 코르 빈산 – 구비 세포에 의해 방출되는 아스 코르 빈산 세포 ^{(19, 20)에} 의해 비 트랜스페린 바인딩 철의 흡수를 조절하는 데 중요한 역할을하고, 아주 최근의 증거는 아스 코르 빈산도 트랜스페린 바인딩 철의 흡수를 조절된다는 것을 의미합니다 나타납니다 셀 ^(21)에서, 후자는 주요 생리적 철 흡수 경로 ^(22)에 대응한다.

아스 코르 빈산 포유류 ^{(23, 24)} 정상 중추 신경계 기능을 위해 필수적입니다. 함께 부신 피질, 뇌하수체, 흉선, 망막 및 황체로, 뇌는 다른 신체 조직 ^23,25-27에 아스 코르 빈산 상대적으로 높은 농도가 포함되어 있습니다. 또한, 성상 세포 ^{(28, 29)} 및 신경 세포와 같은 세포의 글루타메이트 ³⁰ 두의 노출은 ascorbat 세포 외 공간에 아스 코르 빈산의 방출을 유발하는 것으로 알려져있다전자는 글루타민산에 의한 신경 장애 ^(31)에 대해 신경 세포를 보호하는 것으로 생각된다. 성상 세포에서 글루타메이트에 의한 아스 코르 빈산 자료의 정확한 메커니즘은 알 수 있지만, 우리는 최근 성상 세포의 글루타메이트와 아스파 라진 산염 수송 (GLAST에 의해 글루타메이트 섭취로 인한 부종 세포의 관련을 나타내는 증거를 제공하고, 또한 알려진 흥분성 아미노산 수송 이소 1 [EAAT1 ] 인간)와 같은 아스 코르 빈산 ³² 작은 유기 음이온 투과성 볼륨에 민감한 osmolyte과 음이온 채널 (VSOACs)의 결과의 활성화. VSOAC 형성에 관여 세포막 도관의 분자량은 ^{33, 34 신원을} 식별하기 위해 남아있다.

많은 분석이 분광 형광 및 크로마토 그래피 분석 ^{(35, 36)를} 포함 생물학적 시료에서 아스코르브 산염의 결정을 위해 개발되었지만, 특이도, 민감도, interferenc에 많은 변화가있다화학적 오염 물질, 효과적인 선형 범위 및 끝점 분석 물의 안정성 E. 또한, 분석의 선택에 영향을 다른 중요한 요인은 신속성, 사용의 용이성과 같은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 장치로서 비교적 특수 장비에 접근한다.

여기에서 우리는 배양 된 세포에서 세포 내 아스코의 판정뿐만 아니라, 배양 된 세포로부터 아스코르브-유출의 결정을위한 별도의 분석에 대한 간단하고 매우 구체적인 비색 마이크로 분석을 제시한다. 후자의 분석으로 인해 나트륨 의존 아스 코르 빈산 포터 (SVCTs)가 발표 한 아스 코르 빈산의 신속한 재 흡수에 세포에서 아스 코르 빈산 릴리스의 과소 평가의 문제를 회피하는 것을 목표로하고있다. 두 방법 모두는 우리의 이전의 출판물 ^{19,20,32,37,38의} 일부에 출연했지만,이 원고는 지침과 자신의 효과적인 실행을위한 가이드 라인의 명시 적 세트를 제공합니다.

Protocol

1. 배양 세포에서 세포 내 아스 코르 빈산을 결정 세포 배양 및 수확 표준 배양 절차 19-21,32,38를 사용하여 현탁액 (예를 들어 인간의 백혈병, K562) 또는 부착 세포 (예를 들어, 기본 성상 세포)를 성장. 참고 : 세포, 아스코르브 산염을 포함하는 아스 코르 빈산 하나 아스코르브 산염 또는 DHA 33,39 등으로 배양 된 세포를로드 할 수 있도록. </…

Representative Results

배양 된 서스펜션 세포의 세포 내 아스 코르 빈산의 결정 첫 번째 분석 (그림 1)에서, 세포 내 아스 코르 베이트는 이전에 출판 된 절차 (37)에 의해 페로의 매우 중요한 결정을 사용하여, 페로 시안화하는 페리 시안화 (즉, AO 구분) 감소 아스 코르 빈산 별에 따라 결정된다. 아스 코르 베이트의 검출은 페로 시안화 제 1 철에 의해 철의 환원시킴으로써 ?…

Discussion

본 논문에서는 배양 된 세포의 내부와 세포 구획에서 파생 된 아스 코르 빈산의 결정을위한 두 가지, 신속한 특정 상대적으로 민감한 색채 마이크로의 분석을 제시한다. 분석 표준 실험실 장비 및 시약에 대한 액세스를 완료 할 수 있습니다. 분석에 필요한 적당히 비싼 시약은 L-아스 코르 빈산을 향해 피 분석 특이성의 높은 정도를 부여하는 등의 필수이다 AO이다. 분석은 ?…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate