Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren
Summary
We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.
Abstract
Histologie Volumenrekonstruktion erleichtert die Untersuchung von 3D-Form-und Volumenänderung eines Organs auf der Ebene der Makrostrukturen aus Zellen aufgebaut. Es kann auch verwendet werden, um zu untersuchen und Validierung neuer Techniken und Algorithmen, die in volumetrischen medizinischen Bildgebung und Therapie werden. Erstellen von 3D-High-Resolution-Atlanten von verschiedenen Organen, 1,2,3 ist eine weitere Anwendung der Histologie Volumenrekonstruktion. Dies stellt eine Ressource für die Untersuchung von Gewebestrukturen und die räumliche Beziehung zwischen verschiedenen zellulären Funktionen. Wir präsentieren eine Bildregistrierung Ansatz für die Histologie Volumenrekonstruktion, die eine Reihe von optischen blockface Bilder verwendet. Das rekonstruierte Histologie Volumen stellt eine zuverlässige Form der verarbeiteten Probe ohne breiteten Post-Processing-Registrierungsfehler. Die Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Schnitten von zwei Maus-Brustdrüsen wurden zu den entsprechenden Bildern mit blockface Grenzpunkte von der ed extrahiert registriertges der Probe in der Histologie und blockface Bilder. Die Genauigkeit der Registrierung wurde visuell bewertet. Die Ausrichtung der Makrostrukturen der Brustdrüsen wurde visuell mit hoher Auflösung untersucht.
Diese Studie umreißt die verschiedenen Schritte des Bildregistrierungs Pipeline, von Entfernung der Brustdrüse durch den 3D-Volumenrekonstruktion Histologie. Während 2D-Histologie Bilder zeigen die strukturellen Unterschiede zwischen Paaren von Abschnitten, bietet 3D-Histologie Volumen die Möglichkeit, die Unterschiede in der Form und Volumen der Brustdrüsen zu visualisieren.
Introduction
IGFBP7 (Insulin-like growth factor binding protein 7) ist ein Mitglied der IGF-bindende Proteinfamilie, und es wurde gezeigt, um die IGF-1-Rezeptor-4 zu binden. Herabregulierung von IGFBP7 ist bekannt, mit einer schlechten Prognose bei Brustkrebs 5 korreliert werden, während die Wiedereinführung von IGFBP7 in Xenograft-Tumormodellen hemmt stark die Tumorwachstums 6 durch Induktion von Apoptose und Zellalterung 7. Um die Auswirkungen der IGFPB7 zu untersuchen, wurde ein IGFBP7 null Maus 5 (unveröffentlichte Daten) erstellt. Während diese Mäuse keine Tumore entwickeln, Veränderungen in der Histologie des Eierstock-, Muskel-und Leber sowie Mängel in der Brustdrüse Entwicklungs Strukturierung (unveröffentlichte Daten) zeigen sie. Das defekte Phänotyp wurde angegeben als die null-Mäuse haben kleinere Wurfgrößen und sind unfähig, mehrere große Würfe (unveröffentlichte Daten) zu erhalten.
3D-Histologie Bände haben das Potenzial, um nützliche Informat bietenIonen für quantitative und vergleichende Analysen und Bewertung der pathologischen Befunde in Volumen medizinische Bilder. Dreidimensionales konfokales können zwei-Photonen-Mikroskopie hoher Auflösung Zelle morphologische Information der Drüse an lokalen Speicherbereich 14 zu schaffen, aber eine begrenzte Sichtfeld und Tiefe hat. Histologie Volumenrekonstruktion liefert mehr Informationen über einen viel größeren räumlichen Ausdehnung. Verwendung traditioneller Ansätze gewisse Verzerrung während der Herstellung histologischer Schnitte, wie z. B. Schrumpfung, Expansion, Risse und Falten erwartet. Diese Verzerrungen machen es schwierig, seriellen histologischen Bilder in ein 3D-Stapel Register, um ein 3D-Volumen zu rekonstruieren. Da die Anzahl von aufeinanderfolgenden Abschnitten mit Defekten erhöht die Ähnlichkeiten zwischen intakten Abschnitte reduziert und folglich ist der Registrierungsprozess komplizierter.
Verschiedene Methoden wurden vorgeschlagen, um histologische Schnitte zu registrieren und eine kontinuierliche Histologie vo erstellenlume. Einige Techniken sind abhängig von Intensitätsvariationen 8, und andere werden von der Form der Abschnitte 9 basiert. Bei einigen Proben können die anatomischen Strukturen als Landmarken 10,11 zusammen mit Wahrzeichen-basierte Registrierungsverfahren 12,13 verwendet werden. Aber diese inneren Strukturen möglicherweise nicht nachweisbar sein in der gesamten Menge und für einige Proben keine zuverlässigen anatomischen Strukturen identifiziert werden können. Einige Gruppen haben eine paarweise Anmeldung Ansatz verwendet und registriert in Folge Histologie Bilder einem zum anderen mit Konturen oder anatomischen Strukturen 16-18. Registrieren von Serien Histologie Abschnitte miteinander, ohne die Verwendung von Referenzbildern kann die Registrierung Fehler zu propagieren und ändern Sie die tatsächliche Form der Histologie Lautstärke. Paarweise Anmeldung Ansatz beruht auf der Konsistenz der Form der Histologie Abschnitten und den inneren Strukturen im gesamten Stapel der Bilder; daher dichter Abtastung der Probe, es erfordert dienicht immer möglich ist, z. B. für klinische Proben.
In dieser Pipeline verwenden wir blockface Bilder als eine Reihe von Referenzbildern für die Histologie 19 Volumenrekonstruktion. Blockface Bilder der Paraffingewebeblöcke nach der Montage am Mikrotom genommen und vor jeder Abschnitt wird abgeschnitten. Somit muss Beschädigungen einzelner Serienschnitte Schnitt nicht mit der Registrierung der Serienschnitte 8,11,15 stören. Wir erfassen die blockface Bilder in einer anderen Weise von den anderen Gruppen. Die optischen Block Gesichtsbilder werden von einem telezentrischen Objektiv zu beseitigen oder zu minimieren, den Lauf und perspektivische Verzerrung, die in der Regel tritt auf, wenn mit regulären Linsen in der Optik erhalten. Dies ist einer der Vorteile der vorgeschlagenen Vorgehensweise gegenüber den anderen Methoden veröffentlicht, die blockface Bildgebung durchführen mit regulären Linsen. Die Bilder werden in einem geringen spitzen Winkel getroffen werden, um die Reflexion von der Oberfläche des Blocks zur Kontrastverstärkung zwischen dem TISS verwendenue und Paraffinoberfläche und den Schatten des Gewebes in der Tiefe unter der Oberfläche zu beseitigen Paraffin. Photographische Filter wird auch verwendet, um das Licht, das von der Blockoberfläche und dem Gewebe, um den Kontrast 19 ausgleichen zu polarisieren. Um die Verschiebung des Blocks auf der Rotationsmikrotom korrigieren, zwei bis drei Löcher in den Ecken des Blocks, die in den blockface Bilder leicht nachweisbar sind gebohrt. Die Schwerpunkte dieser Löcher werden zusammen mit Wahrzeichen-basierten starren Anmeldung benutzt, um die Bilder blockface auszurichten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie haben wir eine Bildregistrierung Workflow, um ein 3D-Histologie Volumen aus 2D-Serien Histologie Bilder, die nicht internen zufällig ausgewählten Landmarken oder implantiert Bezugsmarker im Gewebe, die das Gewebe verzerren könnten erfordert rekonstruieren entwickelt. Durch das beschriebene Verfahren werden optische Bilder blockface sich als die Referenzbilder vor dem Schneiden verwendet. Wir verwenden externe Löcher in dem Paraffinblock gebohrt, um beim Ausrichten der Bilder blockface unterstützen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) at Sunnybrook Research Institute for their histology services. Support for this work was provided by the Terry Fox Foundation, the Canadian Breast Cancer Foundation‐the Prairie‐NWT as well as a CIHR grant, #MOP-97996.
Materials
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 Automated Tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast Tissue Embedding Medium |
| Leica EG 1160 Embedding Centre | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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