Ricostruzione di 3-Dimensional Volume Istologia e la sua applicazione per studiare mouse ghiandole mammarie
Summary
We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.
Abstract
Ricostruzione del volume Istologia facilita lo studio della forma 3D e variazione di volume di un organo a livello di macrostrutture costituiti di cellule. Può anche essere usato per studiare e validare nuove tecniche e algoritmi di imaging medico volumetrico e terapie. Creazione di atlanti 3D ad alta risoluzione di diversi organi 1,2,3 è un'altra applicazione di ricostruzione del volume istologia. Ciò fornisce una risorsa per indagare strutture tissutali e la relazione spaziale tra le varie funzioni cellulari. Vi presentiamo un metodo di registrazione di immagini per la ricostruzione del volume istologia, che utilizza una serie di immagini blockface ottiche. Il volume istologia ricostruito rappresenta una forma affidabile del campione trasformati senza propagate errore di registrazione post-processing. I ematossilina eosina (H & E) sezioni colorate di due ghiandole mammarie topo sono stati registrati per le loro immagini blockface corrispondenti utilizzando punti di confine estratti dal ndrges del campione nelle immagini di istologia e blockface. La precisione della registrazione è stata valutata visivamente. L'allineamento delle macrostrutture delle ghiandole mammarie stata anche valutata visivamente ad alta risoluzione.
Questo studio delinea le diverse fasi di questa immagine registrazione conduttura, che vanno dalla escissione della ghiandola mammaria fino alla ricostruzione 3D del volume istologia. Mentre le immagini di istologia 2D rivelano le differenze strutturali tra coppie di sezioni, il volume istologia 3D offre la possibilità di visualizzare le differenze di forma e di volume delle ghiandole mammarie.
Introduction
IGFBP7 (insulina come la proteina legante il fattore di crescita 7) è un membro della famiglia delle proteine IGF-binding, e ha dimostrato di legarsi al recettore IGF1 4. Down-regolazione di IGFBP7 è noto essere correlata con la prognosi nel cancro al seno 5, mentre la reintroduzione del IGFBP7 in modelli di tumore dello xenotrapianto inibisce notevolmente la crescita dei tumori 6 attraverso l'induzione di apoptosi e senescenza cellulare 7. Al fine di studiare gli effetti di IGFPB7, un mouse IGFBP7-null è stato creato 5 (dati non pubblicati). Mentre questi topi non sviluppano tumori, mostrano cambiamenti nella istologia delle ovaie, muscoli e nel fegato, nonché difetti di sviluppo della ghiandola mammaria patterning (dati non pubblicati). Il fenotipo difettoso è stato indicato come i topi nulli hanno dimensioni dei cuccioli più piccoli e sono in grado di sostenere più cucciolate di grandi dimensioni (dati non pubblicati).
Volumi di istologia 3D hanno il potenziale di fornire informat utiliion per le analisi quantitative e comparative e la valutazione di risultati patologici in immagini mediche volumetriche. Confocale tridimensionale, microscopia a due fotoni può fornire cellule di alta risoluzione informazioni morfologica della ghiandola alla misura locale 14, ma ha un limitato campo di vista e profondità. Ricostruzione del volume Istologia fornisce ulteriori informazioni su una maggiore estensione spaziale. Utilizzando approcci tradizionali certa distorsione è anticipata durante la preparazione di sezioni istologiche, come il restringimento, espansione, lacrime e pieghe. Queste distorsioni rendono difficile registrare immagini istologiche seriali in una pila 3D per ricostruire un volume 3D. Poiché il numero di sezioni consecutive con difetti aumenta le somiglianze tra sezioni intatte ridotta e conseguentemente rende il processo di registrazione più complicato.
Diversi metodi sono stati proposti per registrare sezioni istologiche e per creare un istologia vo continualume. Alcune tecniche dipendono da variazioni di intensità 8, e altri sono basati sulla forma delle sezioni 9. Per alcuni esemplari le strutture anatomiche possono essere utilizzate come punti di riferimento 10,11 insieme basato limite-metodi di registrazione 12,13. Ma queste strutture interne potrebbero non essere rilevabile durante l'intero volume e per alcuni esemplari presenti strutture anatomiche affidabili possono essere identificati. Alcuni gruppi hanno utilizzato un approccio di registrazione pair-wise e registrato le immagini istologia consecutive una all'altra utilizzando profili o strutture anatomiche 16-18. Registrazione sezioni istologiche seriali l'un l'altro senza l'uso di immagini di riferimento può propagare errore di registrazione e cambiare la forma reale del volume istologia. Approccio registrazione Pair-saggio si basa sulla coerenza della forma delle sezioni istologici e le strutture interne per tutta la pila di immagini; quindi richiede denso campionamento del campione, chepotrebbe non sempre è possibile, ad esempio, per i campioni clinici.
In questo gasdotto usiamo immagini blockface come un insieme di immagini di riferimento per il volume istologia ricostruzione 19. Blockface immagini sono prese dei blocchi di tessuto paraffina dopo il montaggio sul microtomo e prima di ogni sezione viene tagliata. Così, danni a individuo sezioni seriali taglio non interferisca con la registrazione di sezioni seriali 8,11,15. Catturiamo le immagini blockface in modo diverso dagli altri gruppi. Le immagini dei volti blocco ottico vengono raggiunti con un telecentrico per eliminare o minimizzare la canna e prospettiva distorsione, che di solito si verifica quando si utilizzano lenti regolari in ottica. Questo è uno dei vantaggi del metodo proposto rispetto agli altri metodi pubblicati, che eseguono l'imaging blockface utilizzando lenti regolare. Le immagini sono riprese con una leggera angolazione obliqua di utilizzare la riflessione della superficie del blocco per migliorare il contrasto tra il TISSsuperficie ue e paraffina e di eliminare l'ombra del tessuto in profondità sotto la superficie paraffina. Un filtro fotografico è anche usato per polarizzare la luce proveniente dalla superficie del blocco e il tessuto per bilanciare il contrasto 19. Per correggere lo spostamento del blocco sul microtomo rotativo da due a tre fori sono realizzati negli angoli del blocco, che sono facilmente rilevabili nelle immagini blockface. I centroidi di questi fori sono usati insieme con la registrazione rigida a base di riferimento-per allineare le immagini blockface.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato una registrazione workflow un'immagine di ricostruire un volume istologia 3D da immagini seriali istologia 2D, che non richiede punti di riferimento interni scelti a caso o marcatori fiduciali impiantati all'interno del tessuto, che potrebbero distorcere il tessuto. Con il metodo descritto, immagini blockface ottici stessi vengono utilizzati come immagini di riferimento prima del sezionamento. Usiamo fori esterni praticati nel blocco di paraffina per aiutare ad allineare le i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) at Sunnybrook Research Institute for their histology services. Support for this work was provided by the Terry Fox Foundation, the Canadian Breast Cancer Foundation‐the Prairie‐NWT as well as a CIHR grant, #MOP-97996.
Materials
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 Automated Tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast Tissue Embedding Medium |
| Leica EG 1160 Embedding Centre | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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