Reconstruction de 3-Dimensional Volume histologique et son application à l'étude de souris glandes mammaires
Summary
We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.
Abstract
reconstruction du volume d'histologie facilite l'étude de la forme 3D et le changement de volume d'un organe au niveau des macrostructures constituées de cellules. Il peut également être utilisé pour étudier et valider de nouvelles techniques et des algorithmes d'imagerie médicale volumétrique et thérapies. Création d'atlas 3D à haute résolution des différents organes 1,2,3 est une autre application de la reconstruction du volume de l'histologie. Ceci fournit une ressource pour l'enquête structures tissulaires et la relation spatiale entre les différentes fonctions cellulaires. Nous présentons une approche d'enregistrement d'image pour la reconstruction du volume de l'histologie, qui utilise un ensemble d'images de côté d'îlot optiques. Le volume de l'histologie reconstruite représente une forme fiable de l'échantillon traitées sans erreur propagée d'inscription post-traitement. Les hématoxyline et éosine (H & E) sections colorées de deux glandes mammaires de souris ont été enregistrés à leurs images correspondantes du côté d'îlot en utilisant des points limites extraites de l'éditionges de l'échantillon en histologie et du côté d'îlot images. La précision de l'enregistrement a été évalué visuellement. L'alignement des macrostructures des glandes mammaires a également été évaluée visuellement à haute résolution.
Cette étude définit les différentes étapes de ce pipeline d'enregistrement d'image, allant de l'excision de la glande mammaire par l'intermédiaire de la reconstruction 3D du volume de l'histologie. Bien 2D images histologiques révèlent les différences structurelles entre les paires de sections, le volume de l'histologie 3D permet de visualiser les différences de forme et de volume des glandes mammaires.
Introduction
IGFBP7 (insuline like growth factor protéine de liaison 7) est un membre de la famille des protéines IGF-contraignant, et a été montré pour se lier au récepteur de l'IGF1 4. Régulation à la baisse de IGFBP7 est connu pour être en corrélation avec un mauvais pronostic dans le cancer du sein 5, tandis que la réintroduction de IGFBP7 dans des modèles de xénogreffe de tumeur inhibe fortement la croissance des tumeurs par le biais 6 induction de l'apoptose et la sénescence cellulaire 7. Afin d'étudier les effets de IGFPB7, une souris IGFBP7 nul a été créé 5 (données non publiées). Bien que ces souris ne développent pas de tumeurs, ils montrent des changements dans l'histologie de l'ovaire, du muscle et du foie, ainsi que des défauts dans la structuration du développement des glandes mammaires (données non publiées). Le phénotype défectueux a été indiqué que les souris nulles ont des portées moins nombreuses et sont incapables de soutenir plusieurs grandes portées (données non publiées).
Volumes d'histologie 3D ont le potentiel de fournir des informat utileion pour les analyses et l'évaluation quantitative et comparative des résultats pathologiques dans les images médicales volumétriques. Confocale tridimensionnelle, la microscopie à deux photons peut fournir à haute résolution cellule information morphologique de la glande à mesure locale 14, mais il a un champ de vision limité et la profondeur. reconstruction du volume d'histologie fournit plus d'informations sur une plus grande étendue spatiale. En utilisant des approches traditionnelles de la distorsion est prévu au cours de la préparation de coupes histologiques, tels que le retrait, l'expansion, de larmes et de plis. Ces déformations, il est difficile d'enregistrer des images histologiques en série dans une pile 3D à reconstruire un volume 3D. Comme le nombre de sections consécutives avec des défauts augmente les similitudes entre les sections intactes est réduite et rend le processus d'enregistrement plus compliqué, par conséquent.
Différentes méthodes ont été proposées pour enregistrer les coupes histologiques et à créer un vo histologie continuelume. Certaines techniques dépendent de la variation d'intensité et 8, et d'autres sont basées sur la forme des sections 9. Pour certains spécimens les structures anatomiques peuvent être utilisés comme points de repère 10,11 ainsi que les méthodes d'enregistrement basé repère-12,13. Mais ces structures internes peuvent ne pas être détectable dans tout le volume et pour certains spécimens pas fiables structures anatomiques peuvent être identifiés. Certains groupes ont utilisé une approche d'inscription par paire et enregistré des images d'histologie consécutives un à l'autre à l'aide des contours ou des structures anatomiques 16-18. Enregistrement des coupes en série d'histologie à l'autre sans l'utilisation d'images de référence peut se propager erreur d'enregistrement et modifier la forme réelle du volume de l'histologie. Approche d'inscription par paire repose sur la cohérence de la forme des coupes histologiques et les structures internes à travers l'empilement des images; par conséquent, il nécessite échantillonnage dense de l'échantillon, quipeut-être pas toujours possible, par exemple, pour les échantillons cliniques.
Dans ce pipeline, nous utilisons des images du côté d'îlot comme un ensemble d'images de référence pour la reconstruction du volume de l'histologie 19. Images du côté d'îlot sont prises des blocs de tissus de paraffine après montage sur le microtome et avant chaque section est coupée. Ainsi, les dommages à l'individu des coupes en série coupe n'interfère pas avec l'enregistrement des coupes en série 8,11,15. Nous capturons les images du côté d'îlot d'une manière différente des autres groupes. Les images de visage de bloc optique sont obtenues par une lentille télécentrique pour éliminer ou minimiser le canon et la distorsion de perspective, ce qui se produit généralement lors de l'utilisation des lentilles de l'optique réguliers. C'est l'un des avantages de l'approche proposée par rapport aux autres méthodes publiées, qui effectuent l'imagerie de côté d'îlot à l'aide de lentilles ordinaires. Les images sont prises avec un léger angle oblique à utiliser la réflexion de la surface du bloc pour un rehaussement du contraste entre le tisssurface ue et de la paraffine et pour éliminer l'ombre du tissu en profondeur, sous la surface de la paraffine. Un filtre photographique est également utilisée pour polariser la lumière provenant de la surface du bloc et le tissu pour équilibrer le contraste 19. Afin de corriger le déplacement du bloc sur le microtome rotatif, de deux à trois trous sont percés dans les coins du bloc, qui sont facilement détectables dans les images du côté d'îlot. Les centres de gravité de ces trous sont utilisés avec inscription rigide à base de point de repère pour aligner les images du côté d'îlot.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons développé un enregistrement flux de travail d'image à reconstruire un volume d'histologie 3D de série d'images d'histologie 2D, qui ne nécessitent pas de points de repère internes choisis au hasard ou marqueurs fiduciaires implantés dans le tissu, ce qui pourrait fausser le tissu. Par le procédé décrit, des images du côté d'îlot optiques elles-mêmes sont utilisées comme images de référence avant la coupe. Nous utilisons des trous percés dans extérieure…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) at Sunnybrook Research Institute for their histology services. Support for this work was provided by the Terry Fox Foundation, the Canadian Breast Cancer Foundation‐the Prairie‐NWT as well as a CIHR grant, #MOP-97996.
Materials
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 Automated Tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast Tissue Embedding Medium |
| Leica EG 1160 Embedding Centre | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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