בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em> במבחנה</em> לב היפרטרופיה
Summary
אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.
Abstract
התקדמות טכנולוגית הפכו את העכברים מהונדסים גנטי, בם מהונדס ועכברים בנוקאאוט הגן, כלי חיוני בתחומי מחקר רבים. cardiomyocytes מבוגרים מקובלים מאוד כמודל טוב לפיזיולוגיה הסלולר לב ופתופיזיולוגיה, כמו גם להתערבות תרופתית. עכברים מהונדסים גנטי מונעים את הצורך בתהליכי זיהום cardiomyocyte מסובכים כדי ליצור את הגנוטיפ הרצוי, שאינם יעילים בשל בידול המסוף 'שריר הלב. בידוד והתרבות של שריר לב פונקציונלי גבוהה כמות ובאיכות באופן דרמטי ייהנו מחקר לב וכלי דם ולספק כלי חשוב למחקר התמרה תא איתות ופיתוח תרופות. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת היטב לבידוד של שריר לב עכבר בוגר שיכול להיות מיושם עם קצת אימון. לב העכבר הוא נכרת וcannulated למערכת לב מבודדת, אז perfused עם p-סידן חופשי וגבוהotassium חיץ ואחריו סוג II עיכול collagenase במצב זלוף המדרדר Langendorff. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית עבור האוסף של שריר לב עכבר בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.
Introduction
שריר לב הוא לא שגשוג. יש כמה שורות תאי cardiomyocyte פרוזדורים, כמו HL-1 ו-AT-1 תאים שמקורם בגידולי פרוזדורי עכבר; עם זאת, אין קווים סלולריים cardiomyocyte חדרית המבוגר זמינים למחקר. תרביות תאים ראשוניות של שריר לב עכבר מבוגר לספק מודל רב עוצמה למחקר לב ברמה התאית ומולקולרית. עד כה, הם היו בשימוש נרחב למחקר ביוכימי, פיסיולוגי, ותרופתי 1. בנוסף, השימוש התכוף בעכברים מהונדסים גנטי יש חייבת שיטות יעילות של בידוד cardiomyocyte. תרבות טהורה מאפשרת לתנאים חופשיים מאינטראקציה עם איברים אחרים ומחזור המערכתי, כגון באמצעות גורמי neurohormonal ודמוי הורמון אנדוגני 2,3. עם זאת, בידוד מוצלח של שריר לב יכול להיות מאתגר.
הפרוטוקול אנחנו מציגים כאן מבוסס על החוויות שלנו עם cardiomyocyt חולדה הבוגרתes ואת השיטה שתוארה על ידי או 'קונל ואח' 4,5. במיוחד ב2007 5, הם תיארו טכניקות מפורטות מהכנות חיץ לתרבית תאים וassay הפונקציונלי. מאז myocytes העכבר רגישים מאוד להתכווצות שריר הלב בהשוואה לעכברים, המאגרים או מדיה המשמשים לזלוף, עיכול, Ca 2 + סובלנות, ציפוי והתרבות בפרוטוקול העכבר הם השלימו עם מעכב ספציפי עירור התכווצות צימוד, 2, monoxime 3-Butanedione (BDM) לעכב ההתכווצות הספונטנית שלהם, ומכאן את יכולת הקיום והתשואה של myocytes בצורת המוט לשפר באופן משמעותי. בפרוטוקול הציג כאן, myocytes מופרד בחיץ אשלגן גבוה מהלב המבודד על ידי זלוף Langendorff שונה עם הסוג II collagenase. Collagenase השני שובר בצורה יעילה את המטריצה הבינה תאית ותאים משחרר. פתרון זלוף גם שומר חילוף חומרים תאיים ברמה נמוכה 6. בadditiב, מערכת הלב המבודדת מהרווארד Apparatus אנחנו משמשים כאן היא מעוצבים היטב לטמפרטורה מדויקת ושליטה בלחץ קבועה 7. גישה זו מספקת הכנות לשחזור מאוד ואוכלוסיות אחידות מסוג התא בודד, שניתן להשתמש בם בתרבות הלילה למדידת חלבוני איתות או תרבות 2-3 יום למבחני hypertrophic לב.
Protocol
Representative Results
Discussion
לעריכה הטובה ביותר, השלבים הקריטיים ביותר הם: 1) מייד משדלת את לב העכבר לצינורית לאחר כריתה; 2) זלוף לב המתאים. כמו כן, שימו לב כי איכות מים, טמפרטורת זלוף, ה-pH של חיץ, עיקור, טוהר כימי, וצינורות נקיים, שאינו מזוהם ותאים הם גם גורמים חשובים. 18.2 mΩ H כיתה ביולוגיה המולקולרי 2 O מומלץ ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL-36,573. אנו מודים למר דוד Sowa לעריכת כתב היד הזה.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R., Gross, D. R. . Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
