細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em> in vitroで</em>心肥大
Summary
我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。
Abstract
技術の進歩は、遺伝子導入および遺伝子ノックアウトマウスは、多くの研究分野において不可欠なツールを含む、遺伝子改変マウスを作った。大人の心筋細胞は広く、心臓細胞生理学や病態生理のためだけでなく、薬学的介入のための良いモデルとして受け入れられています。遺伝子改変マウスは、心筋細胞 '最終分化に非効率的で必要な遺伝子型を生成するために、複雑な心筋細胞の感染プロセスの必要性を排除する。高量と質の機能的心筋細胞の単離および培養は劇的に循環器病研究の利益と細胞シグナル伝達研究や薬剤開発のための重要なツールを提供します。ここでは、少しのトレーニングを実施することができる成体マウス心筋細胞の単離のための十分に確立された方法を記載する。マウスの心臓を摘出し、孤立した心臓のシステムにカニューレを挿入し、その後、カルシウムを含まない、高Pで灌流otassiumバッファは、ランゲンドルフ逆行灌流モードでのII型コラゲナーゼ消化した。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能成体マウスの心筋細胞の収集のための一貫性のある結果が得られます。
Introduction
心筋細胞は、増殖性ではありません。 HL-1およびマウス心房腫瘍由来AT-1細胞のようないくつかの心房心筋細胞系があり、;しかし、研究のために利用可能な大人の心室の心筋細胞株は存在しない。成体マウスの心筋細胞の初代細胞培養は、細胞および分子レベルでの心臓研究のための強力なモデルを提供する。今日まで、これらは生化学的、生理学的、および薬理学的研究1のために広く使用されてきた。さらに、遺伝子改変マウスを頻繁に使用すると、心筋細胞の単離の効果的な方法を必要としている。純粋培養では、内因性神経ホルモンやホルモン様因子2,3を介するなどの他の臓器や体循環との相互作用から自由な条件を可能にします。しかし、心筋細胞の正常な絶縁が困難な場合があります。
我々はここに紹介するプロトコルは、成体ラットcardiomyocytと私たちの経験に基づいていますESとオコンネルら 4,5に記載されている方法。特に2007 5は、それらは、細胞培養および機能アッセイ緩衝液製剤からの詳細な技術を説明した。マウス筋細胞がラットの心筋細胞に比べて拘縮を非常に受けやすいので、マウスプロトコルでの灌流、消化、Ca 2 +の寛容、メッキ、培養に用いるバッファまたはメディアは、非特異的な興奮収縮連関阻害剤、2を補足している彼らの自発収縮を阻害する3 – ブタンジオンモノオキシム（BDM）は、したがって生存棒状筋細胞の収量が有意に改善する。ここで紹介するプロトコルでは、筋細胞はII型コラゲナーゼを有する改変ランゲンドルフ灌流によって単離心臓から高カリウムバッファーで分離される。コラゲナーゼIIは、効果的に細胞間マトリックスを解放細胞を分解します。灌流液は、低レベル6で、細胞の代謝を維持します。 additi中で、ここで使用されるハーバード装置から分離した心臓システムは、正確な温度と一定の圧力制御7用にうまく設計されている。このアプローチは、非常に再現性製剤および心臓肥大アッセイのためのシグナル伝達タンパク質または2-3日培養を測定するための一晩培養に使用することができる単一の細胞型の均一な集団を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
最高の準備のために、最も重要なステップは次のとおりです。1）速やかに切除した後にカニューレにマウス心臓をフック。 2）適切な心臓灌流。また、その水質、潅流温度、緩衝液のpH、滅菌、化学的純度、クリーン、非汚染されたチューブに注意し、室内も重要な要素である。 18.2mΩの分子生物学グレードのH 2 Oが非常にバッファの準備をお勧めします。 200のATP原液のpHは7.2、見逃しやすいステッ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立心肺血液研究所助成HL-36573によってサポートされていました。我々は、この原稿を編集するためのデービッド·ゾーヴァに感謝します。
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
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