からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em>ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための>組織
Summary
ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。
Abstract
キイロショウジョウバエ胚および幼虫の組織はしばしば、これらの組織における遺伝子発現の分析を複雑にすることができる細胞型の高度に不均一な混合物を含有する。従って、 ショウジョウバエ組織からの細胞特異的遺伝子発現プロファイルを分析するために、高純度のような転写プロファイリングおよびクロマチン免疫沈降などの下流のアプリケーションに十分な収率で特定の細胞型を単離することが必要であり得る。しかしながら、これらの組織における特定の細胞型の稀な集団と結合し、中枢神経系のような組織内の不規則な細胞形態は、例えば、レーザーマイクロダイセクションおよび蛍光活性化細胞選別（FACS）などの細胞単離の伝統的な方法のための課題を提起することができ。ここで、タグ付けされた核の親和性に基づく分離ではなく、全細胞を用いた細胞特異的遺伝子発現プロファイルを特徴付けるための別のアプローチは、記載されている。特定のC言語での核興味のあるエル·タイプは、遺伝的にGal4/UASバイナリー発現系を用いて核膜に局在するEGFPタグで標識する。これらのEGFPタグ付き核磁気ビーズに結合されるGFPに対する抗体を用いて単離することができる。このプロトコルで説明されたアプローチは、これらの細胞型には、全細胞集団の2％未満を含む場合であっても、高純度でかつ発現分析のために十分なレベルで、ショウジョウバエの幼虫中枢神経系の特定の細胞型からの核の一貫した分離を可能にする組織。このアプローチは、 ショウジョウバエ胚および特定のGal4のドライバを使用して、幼虫の多種多様な細胞型から核を単離するために使用することができ、FACSまたはレーザーマイクロダイセクションには適していない細胞型から核を単離するために有用であり得る。
Introduction
中枢神経系のようなショウジョウバエ組織は細胞型の複雑な混合物を含有する。従って、 ショウジョウバエ組織からの細胞特異的遺伝子発現プロファイルを分析するために、それは下流の適用を可能にするのに十分な量の特異的細胞の均質な集団を単離することがまず必要である。無傷の組織から細胞を単離するための方法は、全細胞のレーザーマイクロダイセクション、および蛍光活性化細胞選別（FACS）が挙げられる。 FACS 1-3遺伝子発現プロファイリングおよびクロマチンのためのショウジョウバエ胚から線虫（Caenorhabditis elegans）由来の細胞および核を単離するために使用されてきたが、FACS、レーザーマイクロダイセクションは、高度に相互に混合細胞型を含むかを有する細胞を含有する組織において正常に行うことが困難であることができるニューロンなどの不規則な形態、。この困難を克服するために、核ではなく、細胞が特定の細胞型から単離し、その後の世代のために使用することができる電子発現プロファイリング。重要なことに、核RNA試料を用いたマイクロアレイベースmRNA発現分析は、総RNA 4,5を用いて行わとほぼ同等の結果を示している。また、核のRNAを用いた遺伝子発現解析は、正常C.含む複数の生物における遺伝子発現を研究するために使用されている線虫 、 シロイヌナズナ 、 ショウジョウバエ、およびヒト4、5 2、3。
いくつかのアプローチが最近、遺伝子発現解析及び/又はクロマチン免疫沈降するのに適しているショウジョウバエの組織からの標識された核の特定の集団を単離するために記載されている。免疫沈降（BITS-チップ）方式のための組織特異的なクロマチンのバッチ分離が核に局在するGFP 2の細胞型特異的発現に基づいて固定された核を分離するために、FACSを利用しています。このアプローチは、SUでしたccessfully ショウジョウバエの胚の中胚葉2から単離された核のクロマチン免疫沈降を用いて、ヒストン修飾と転写因子の分布を解析するために使用される。しかし、FACSベースのアプローチは、ダウンストリームアプリケーションのための適切な数値を得るために必要な増加したソート時間に混合された集団のわずかな割合を構成標識核を単離するにはあまり適切であり得る。これらの制限を克服するために、いくつかのグループが、特定の細胞型に特異的なエピトープで標識された核を精製するために親和性に基づく分離技術を利用している。 シロイヌナズナ6,7における使用のために開発された特定の細胞型（INTACT）メソッドのタグ付け核の単離は、最近、 ショウジョウバエ 8での使用に適合されている。この方法では、in vivoでのビオチン化のための基質である核エンベロープ融合タンパク質であるcoexpres特定の細胞型において大腸菌ビオチンリガーゼBirAを用いてセッド。ビオチン標識された核は、続いてストレプトアビジン – ベースの親和性単離を用いて混合集団から精製することができる。このアプローチを用いて、核は正常核エンベロープ融合タンパク質は中胚葉特異的エンハンサー8の制御下で発現させたショウジョウバエ胚の中胚葉に標識し、単離した。著者らはまた、Gal4の調節配列、UAS 9の制御下で任意の細胞型で発現させることができる核エンベロープ融合タンパク質を生成した。このアプローチは、急速に混合集団から標識核のサブセットを単離することができるが、3つの別々のトランスジェニック構築物を必要とし、したがって特定の遺伝子の用途には不向きであってもよい。最近、このアプローチは、核膜の内膜に局在SUN（S AD1及びUN-C 84）ドメイン含有タンパク質を用いてタグ付けされた記載されている蛍光タンパク質とGal4/UASシステム10の制御下で発現。核は、核膜の外膜を除去するために非イオン性界面活性剤の存在下で単離され、抗GFP抗体に結合した磁気ビーズを用いてアフィニティー精製した。このアプローチは、正常ショウジョウバエ 10の成体脳内の特定のニューロンのサブタイプからの標識された核の小集団を単離するために使用した。
ここで、 ショウジョウバエ幼虫の組織からの細胞の混合集団から標識核を単離するためのプロトコルが記載されている。この方法は、独立して開発されたが、ヘンリーらによって記載されたアプローチに似ていた。10まず、核が混合集団からのタグ付けされた核のその後の単離を容易にするためにのみキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）における特定の細胞型で発現される蛍光タグで標識した親和性ベースのアプローチを使用して。核を標識するために、KASH（Kの larsicht / NC-1 / Sの -インの時間 omology）ドメインを利用した。 KASHドメインは、核周囲の空間11内に日ドメイン含有タンパク質との相互作用を介して部分的には、核膜の外膜に局在する膜貫通ドメインである。そのN末端 ドメインは、細胞質12-14におけるアクチンまたは微小管などの細胞骨格タンパク質と相互作用しながら、ショウジョウバエ MSP-300およびKlarsichtなどのタンパク質のC-末端KASHドメインは、外核膜にこれらのタンパク質を固定する。構築物は、ここで、ショウジョウバエ MSP-300のKASHドメインはのpUASTベクターのattB-15、16でGal4の調節配列、UASの制御下で、EGFPのC末端に融合された生成された。ラーゼPhiC31の部位特異的組込みを使用して、トランスジェニックハエをUAS-EGFP :: MSP-300 KASH導入遺伝子が染色体上attP2遺伝子座に挿入された生成された3L 17。 UAS-EGFP :: MSP-300 KASHハエは、目的の細胞型における外顆粒膜上の標的EGFP発現をもたらす、特定の細胞型においてGal4ドライバーを発現するハエと交配させることができる。標識された核は、磁気ビーズに結合されたGFPに対する抗体を用いて、混合細胞集団から精製することができる。 EGFPタグは、外核膜の細胞質側に局在し、したがって、抗体にアクセス可能であるため、このアプローチでは、非イオン性界面活性剤の使用が必要とされない。
プロトコルは、以下に説明/単離するショウジョウバエ幼虫の組織における特定の細胞型からのEGFP-標識核を富化、単離された核の純度および収率を定量化するため、および定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRTに適した核内RNAを抽出するために使用することができる-PCR）遺伝子発現解析。 TISSU除く分離と核のアフィニティー精製（電子郭清）1時間未満で行うことができる。結果は、グリア細胞核は正常幼虫の光学ローブと眼成虫盤から単離し、その後の遺伝子発現分析のために使用することができることを示して提示される。なお、この方法は、標的細胞は、総人口の5％未満を構成する胚および幼虫の組織からの標識された核の分離/富化のために有用であろうことが予想される。この研究で生成されたすべてのショウジョウバエの株式やプラスミドは要望に応じて作成者から入手できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、 ショウジョウバエの胚または幼虫組織における混合細胞集団から、特にタグ付けされた核を隔離するか、非常に豊かにするために使用できます。このプロトコルを使用して、核は約1時間で解剖した組織から単離することができる。単離された核の純度および収率は、実験的に各細胞型について決定されなければならない。それがために、試料中に存在するビーズ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、UAS-EGFP :: MSP-300 KASHプラスミドを提供するためのジャニス·フィッシャーに感謝します。 mAB24B10抗体はNICHDの後援の下に開発された発生研究ハイブリドーマバンクから得られ、アイオワ大学、生物学科によって維持された。 レポGAL4株 （BL7415）は、インディアナ大学ブルーミントンストックセンターから入手した。がん研究のためのパデュー大学センター米国癌協会の制度研究助成（IRG番号58-006-53）からの支援を感謝して承諾されます。 Jingqun MAはパデュー大学からの食糧農業におけるパデュー助手の農業研究によってサポートされています。
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. Genetics. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
