בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em> דרוזופילה</em> רקמות לניתוח ביטוי גנים
Summary
רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.
Abstract
רקמות עוברי וזחל melanogaster דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית מאוד של סוגי תאים, אשר יכול לסבך את הניתוח של ביטוי גנים ברקמות אלה. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, ייתכן שיהיה צורך לבודד את סוגי תאים ספציפיים עם טוהר גבוה ובתשואות מספיק עבור יישומים במורד כגון פרופיל תעתיק וimmunoprecipitation הכרומטין. עם זאת, המורפולוגיה בלתי סדירה הסלולרית ברקמות כגון מערכת העצבים המרכזית, בשילוב עם האוכלוסייה נדירה של סוגי תאים ספציפיים ברקמות אלה, יכול להוות אתגר לשיטות מסורתיות של בידוד תא כגון microdissection לייזר ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) . כאן, גישה חלופית לאפיון פרופילי ביטוי גני תא ספציפי באמצעות בידוד המבוסס על זיקה של גרעינים מתויגים, ולא תאים שלמים, הוא תאר. גרעינים בג הספציפיסוג ell עניין מסומנים גנטי עם תג EGFP גרעיני מקומי מעטפה באמצעות מערכת הביטוי בינארי Gal4/UAS. יכולים להיות מבודדים גרעינים מתויג EGFP אלה באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP שהם מצמידים את חרוזים מגנטיים. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשר בידוד של גרעינים עולה בקנה אחד מסוגי תאים מסוימים במערכת העצבים המרכזית דרוזופילה הזחל בטוהר גבוה וברמות מספיקות לניתוח ביטוי, גם כאשר אלו סוגי תאים מהווים פחות מ -2% מכלל האוכלוסייה בתא רקמות. גישה זו יכולה לשמש כדי לבודד גרעינים ממגוון רחב של דרוזופילה עוברית וסוגי תאי זחל באמצעות Gal4 נהגים ספציפיים, ועשויה להיות שימושי עבור בידוד גרעינים מסוגי תאים שאינם מתאימים לFACS או microdissection לייזר.
Introduction
רקמות דרוזופילה כגון מערכת העצבים המרכזית מכילות תערובת מורכבת של סוגי תאים. לכן, כדי לנתח את פרופילי ביטוי גני תא ספציפי מרקמות דרוזופילה, יש צורך קודם כל לבודד אוכלוסייה הומוגנית של תאים ספציפיים בכמויות מספיקות כדי לאפשר ליישומים במורד הזרם. שיטות לבודד תאים מרקמות שלמות כוללות microdissection לייזר, ותא הקרינה המופעל מיון (FACS) של כל תאים. בעוד FACS נעשה שימוש כדי לבודד את התאים וגרעינים מעוברי דרוזופילה ומelegans Caenorhabditis לביטוי גנים והכרומטין פרופיל 1-3, FACS וmicrodissection הלייזר יכולים להיות קשים לביצוע בהצלחה ברקמות המכילות סוגים מעורבבים מאוד תא או תאים מכילים שעם מורפולוגיה לא סדירה, כגון תאי עצב. כדי להתגבר על הקושי הזה, יכול להיות מבודדים מסוגי תאים ספציפיים גרעינים ולא תאים ומשמשים לדור הבאביטוי פרופיל דואר. חשוב לציין, ניתוח ביטוי mRNA microarray המבוסס באמצעות דגימות RNA גרעיניות מראה תוצאות בדרך כלל דומות לזו שבוצעה באמצעות RNA הכולל 4, 5. יתר על כן, ניתוח ביטוי גנים באמצעות RNA הגרעיני שמש בהצלחה ללמוד ביטוי גנים באורגניזמים רבים, כולל ג elegans, thaliana ארבידופסיס, דרוזופילה, ובני אדם 4, 5 2, 3.
לאחרונה כמה גישות תוארו לבידוד של אוכלוסיות ספציפיות של גרעינים שכותרתו מרקמות דרוזופילה המתאימים לניתוח ביטוי גנים ו / או immunoprecipitation הכרומטין. הבידוד אצווה של הכרומטין רקמות ספציפיות לשיטת immunoprecipitation (סיביות שבב) מנצל FACS לבודד את גרעינים קבועים על הבסיס של ביטוי תאים מסוג מסוים של ה-GFP-לוקליזציה הגרעינית 2. גישה זו כבר successfully משמש כדי לנתח את התפלגות שינויי היסטון וגורמי שעתוק באמצעות immunoprecipitation הכרומטין של גרעינים מבודדים מהמזודרם בעוברי דרוזופילה 2. עם זאת, גישות מבוססות FACS עשויות להיות פחות מתאימות לבידוד גרעינים שכותרתו, המהווים רק חלק קטן מאוכלוסייה מעורבת בשל זמן מין המוגבר הדרוש כדי להשיג מספרים מתאימים ליישומים במורד הזרם. כדי להתגבר על מגבלות אלה, כמה קבוצות יש שימוש בטכניקות בידוד מבוסס זיקה לטהר גרעינים שמסומנים עם epitope ספציפי בסוג תא מסוים. לאחרונה הבידוד של גרעינים מתויגים בסוגי תאים מסוימים בשיטה (שלמה) שפותחו לשימוש בthaliana ארבידופסיס 6, 7 הותאם לשימוש בדרוזופילה 8. בשיטה זו, חלבון היתוך מעטפת גרעין שהוא מצע לin vivo biotinylation הוא coexpresSED עם האנזים ביוטין החיידקים Escherichia בירה בסוגי תאים ספציפיים. גרעינים שכותרתו ביוטין יכולים להיות מטוהרים לאחר מכן מאוכלוסיות מעורבות באמצעות בידוד זיקה מבוסס streptavidin. שימוש בגישה זו, גרעינים תויגו בהצלחה ומבודדת מהמזודרם בעוברי דרוזופילה בי חלבון היתוך מעטפת הגרעין באו לידי ביטוי בשליטה של משפר המזודרם ספציפי 8. המחברים גם נוצרו חלבוני איחוי מעטפת גרעין שיכול לבוא לידי ביטוי בכל סוג תא שבשליטתו של רצף הרגולציה Gal4, 9 כטב"מ. גישה זו היא מסוגלת במהירות בידוד תת קבוצות של גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות מעורבות, אבל דורשת שלושה מבנים מהונדסים נפרדים ולכן עשוי להיות מתאים ליישומים גנטיים מסוימים. לאחרונה, גישה שתוארה שביום ראשון (S AD1 והאו"ם C-84) המכיל חלבונים תחום זה בתרגום להממברנה הפנימית של מעטפת הגרעין תויגו עםחלבוני ניאון והביע תחת שליטה של מערכת Gal4/UAS 10. גרעינים היו מבודדים בנוכחות של חומר ניקוי nonionic להסיר את הקרום החיצוני של מעטפת הגרעין, וזיקה מטוהרת באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים אנטי-GFP. גישה זו משמשת בהצלחה לבודד אוכלוסיות קטנות של גרעינים שכותרתו מתת עצביים ספציפיים במוח הבוגר בדרוזופילה 10.
כאן, פרוטוקול לבידוד של גרעינים שכותרתו מאוכלוסייה מעורבת של תאים מרקמות זחל דרוזופילה מתואר. שיטה זו פותחה באופן עצמאי, אך דומה לגישה שתוארה על ידי הנרי ואח'. 10 ראשית, גרעינים תויגו עם תג הניאון שבא לידי ביטוי רק בסוגי תאים מסוימים בדרוזופילה melanogaster כדי להקל על הבידוד הבא של גרעינים מתויגים מאוכלוסיות מעורבות באמצעות גישה המבוססת על זיקה. כדי לתייג את הגרעינים,תחום KASH (larsicht K / omology שעות yne NC-1 / S) נוצל. תחום KASH הוא תחום הטרנסממברני שמתאים להממברנה החיצונית של מעטפת הגרעין, בחלקו דרך אינטראקציות עם חלבונים המכיל תחום SUN בתוך המרחב perinuclear 11. תחום KASH טרמינל C-של חלבונים כגון דרוזופילה MSP-300 וKlarsicht מעגן את החלבונים האלה קרום הגרעין החיצוני, בעוד תחומים N-מסוף שלהם אינטראקציה עם חלבוני שלד תא, כגון אקטין או microtubules ב12-14 ציטופלסמה. בונה נוצרה בי תחום KASH של דרוזופילה MSP-300 היה התמזגו לC-הסופית של EGFP, תחת שליטה של רצף Gal4 רגולציה, כטב"מ בוקטור pUAST-attB 15, 16. באמצעות אינטגרציה באתר ספציפי phiC31, זבובים מהונדסים נוצרו בי כטב"מ-EGFP :: transgene MSP-300 KASH הוכנס בלוקוסי attP2 על כרומוזום3L 17. כטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH זבובים ניתן חצו עם זבובים המבטאים את נהג Gal4 בסוג תא מסוים, וכתוצאה מכך הביטוי הממוקד של EGFP בקרום הגרעין החיצוני בסוג התא של עניין. אז יכולים להיות מטוהרים גרעינים שכותרתו מאוכלוסיות תאים מעורבים באמצעות נוגדנים נגד ה-GFP מצמידים את החרוזים מגנטיים. בגישה זו, השימוש בחומרי ניקוי nonionic לא נדרש כי תג EGFP הוא מקומי לצד cytoplasmic של קרום הגרעין החיצוני, ולכן נגיש לנוגדנים.
הפרוטוקול המתואר להלן יכול לשמש כדי לבודד / להעשיר את הגרעינים שכותרתו EGFP מסוגי תאים ספציפיים ברקמות זחל דרוזופילה, לכמת את טוהר ואת התשואה של גרעינים מבודדים, וכדי לחלץ RNA הגרעיני מתאים לתגובת שרשרת כמותיים הפוך שעתוק פולימרז (qRT -PCR) ניתוח ביטוי גנים. הבידוד וזיקה לטיהור של גרעינים (לא כולל Tissuנתיחת דואר) יכולה להתבצע בפחות משעה. תוצאות מוצגות מראים כי גרעיני גליה ניתן לבודד בהצלחה מהאונה אופטי זחל ודיסק דמותי בעיניים, ומשמשים לניתוח ביטוי גנים שלאחר מכן. זה צפוי כי גישה זו תהיה שימושית עבור הבידוד / ההעשרה של גרעינים שכותרתו מרקמות עוברי וזחל שבו תאי היעד מהווים פחות מ -5% מכלל האוכלוסייה. כל מניות דרוזופילה ופלסמידים שנוצרו במחקר זה הם זמינים מהמחברים על פי דרישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד או מאוד להעשיר במיוחד גרעינים מתויגים מאוכלוסיות תאים מעורבות בעוברי דרוזופילה או רקמות זחל. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד מרקמות גזורים גרעינים בכ 1 שעות. טוהר והתשואה של הגרעינים המבודדים חייבים להיקבע באופן ניסיוני לכל סוג ת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג'ניס פישר למתן פלסמיד כטב"מ-EGFP :: MSP-300 KASH. נוגדן mAB24B10 הושג ממחקרי Hybridoma הבנק התפתחותית שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה. מניית repo-GAL4 (BL7415) התקבלה ממרכז מלאי בלומינגטון באוניברסיטת אינדיאנה. תמיכה מהאגודה האמריקנית לסרטן המוסדי מענק המחקר (IRG # 58-006-53) למרכז אוניברסיטת פרדו לחקר הסרטן היא הודה בהכרת תודה. Jingqun מא נתמך על ידי מחקר חקלאי בבית הפרד assistantship במזון וחקלאות מאוניברסיטת פרדו.
Materials
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9 well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
- Weake, V. M., et al. Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation. Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).
- Bonn, S., et al. Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP. Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).
- Haenni, S., et al. Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3′-end-seq. Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).
- Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells. BMC Genom. 8, 340 (2007).
- Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei. Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).
- Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).
- Deal, R. B., Henikoff, S. A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue. Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genom. Res. 22, 766-777 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).
- Starr, D. A. KASH and SUN proteins. Curr Biol. 21, 414-415 (2011).
- Fischer, J. A., et al. Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye. Genetics. 168, 1385-1393 (2004).
- Patterson, K., et al. The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).
- Yu, J., et al. The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).
- Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye. Fly. 1, 75-85 (2007).
- Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).
- Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).
