Isolation basée sur l'affinité de Tagged noyaux de<em> Drosophila</em> tissus pour l'analyse de l'expression génique

Summary

Tissus de Drosophila contiennent souvent un mélange hétérogène de types de cellules. Afin d'examiner l'expression des gènes dans des types de cellules spécifiques d'un tissu particulier, les noyaux peuvent être génétiquement marqués et ensuite isolés en utilisant une approche basée sur l'affinité. Des noyaux isolés peuvent être utilisés pour des applications en aval tels que l'analyse de l'expression génique et immunoprécipitation de la chromatine.

Abstract

Les tissus embryonnaires et les larves de Drosophila melanogaster contiennent souvent un mélange très hétérogène de types de cellules, ce qui peut compliquer l'analyse de l'expression génique dans ces tissus. Ainsi, pour analyser les profils d'expression de gènes spécifiques des cellules provenant de tissus de Drosophila, il peut être nécessaire d'isoler des types cellulaires spécifiques avec une grande pureté et à des rendements suffisants pour des applications en aval, tels que le profilage de la transcription et immunoprécipitation de la chromatine. Cependant, la morphologie cellulaire irrégulière dans des tissus tels que le système nerveux central, couplé à la population rare de types de cellules spécifiques dans ces tissus, peut poser des problèmes pour les méthodes traditionnelles d'isolement des cellules, tels que la microdissection laser et cellulaire activé par fluorescence (FACS) . Ici, une approche alternative pour la caractérisation des profils d'expression de gènes spécifiques des cellules en utilisant l'isolement par affinité à base de noyaux marqués, plutôt que des cellules entières, est décrite. Noyaux dans le c spécifiquetype d'intérêt de coude sont génétiquement marqué avec une étiquette de EGFP enveloppe nucléaire localisée en utilisant le système d'expression binaire GAL4/UAS. Ces noyaux d'EGFP-étiqueté peuvent être isolés en utilisant des anticorps contre la GFP qui sont couplés à des billes magnétiques. L'approche décrite dans ce protocole permet l'isolement cohérente des noyaux à partir de types de cellules spécifiques dans le système larvaire nerveux central chez la drosophile à haute pureté et à des niveaux suffisants pour une analyse d'expression, même si ces types de cellules comprennent moins de 2% de la population cellulaire totale dans l' tissu. Cette approche peut être utilisée pour isoler les noyaux à partir d'une grande variété de Drosophila embryonnaire et types de cellules en utilisant des larves de Gal4 pilotes spécifiques, et peut être utile pour isoler les noyaux de types de cellules qui ne conviennent pas pour FACS ou microdissection par laser.

Introduction

Drosophila tissus tels que le système nerveux central contiennent un mélange complexe de types cellulaires. Ainsi, pour analyser les profils d'expression de gènes spécifiques des cellules provenant de tissus de Drosophila, il est d'abord nécessaire d'isoler une population homogène de cellules spécifiques dans des quantités suffisantes pour permettre à des applications en aval. Des procédés pour isoler des cellules provenant de tissus intacts comprennent microdissection par laser, et la cellule activé par fluorescence (FACS) de cellules entières. Bien que FACS a été utilisé pour isoler des cellules et des noyaux d'embryons de Drosophila et de Caenorhabditis elegans pour l'expression génique et la chromatine de profilage ^1-3, FACS et microdissection laser peuvent être difficiles à effectuer avec succès dans des tissus qui contiennent des types de cellules très mélangés entre eux ou que les cellules contiennent avec morphologie irrégulière, telles que les neurones. Pour surmonter cette difficulté, plutôt que les noyaux des cellules peuvent être isolées à partir de types de cellules spécifiques et utilisés pour gen suivantee profilage de l'expression. Fait important, l'analyse d'expression de l'ARNm à base de puces à ADN, en utilisant des échantillons d'ARN nucléaires montre des résultats généralement comparables à celles effectuées en utilisant l'ARN total de ^{4, 5.} En outre, l'analyse de l'expression du gène en utilisant l'ARN nucléaire a été utilisée avec succès pour étudier l'expression des gènes dans plusieurs organismes, y compris C. elegans, Arabidopsis thaliana, la drosophile, et les êtres humains ^{4, 5 2, 3.}

Plusieurs approches ont été récemment décrite pour l'isolement de populations spécifiques de noyaux marqués à partir de tissus de Drosophila qui sont appropriés pour l'analyse de l'expression génique et / ou immunoprécipitation de la chromatine. L'isolement de lot de la chromatine tissu-spécifique pour la méthode immuno-précipitation (BiTS-Chip) utilise FACS pour isoler les noyaux fixes sur la base d'un type de cellule spécifique expression de la GFP nucléaire localisée ^2. Cette approche a été successfully utilisé pour analyser la distribution des modifications des histones et des facteurs de transcription à l'aide d'immunoprécipitation de la chromatine des noyaux isolés du mésoderme d'embryons de Drosophila ^2. Cependant, les approches basées sur FACS peuvent être moins approprié pour isoler noyaux marqués qui constituent seulement une petite proportion d'une population mixte en raison du temps de tri accrue nécessaire pour obtenir un nombre adéquat pour des applications en aval. Pour surmonter ces limitations, plusieurs groupes ont utilisé des techniques d'isolement basées sur l'affinité pour purifier les noyaux qui sont marqués avec un épitope spécifique d'un type cellulaire particulier. L'isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques de la méthode (INTACT) développés pour une utilisation chez Arabidopsis thaliana ^{6, 7} a récemment été adapté pour être utilisé chez la drosophile ^8. Dans ce procédé, une protéine de fusion de l'enveloppe nucléaire qui est un substrat pour la biotinylation in vivo est coexpressed avec la biotine ligase de Escherichia coli BirA dans des types cellulaires spécifiques. les noyaux marqués à la biotine peuvent être ensuite purifiés à partir de populations mixtes à l'aide de l'isolement d'affinité basée streptavidine. En utilisant cette approche, les noyaux ont été marqués avec succès et le mésoderme isolés à partir d'embryons de Drosophila, dans lequel une protéine de fusion de l'enveloppe nucléaire a été exprimée sous le contrôle d'un amplificateur ^{spécifique-8} du mésoderme. Les auteurs ont également généré des protéines nucléaires enveloppe de fusion qui peuvent être exprimées dans n'importe quel type de cellule sous contrôle de la séquence régulatrice Gal4, UAS ^9. Cette approche est capable d'isoler rapidement des sous-ensembles de noyaux marqués de populations mixtes, mais nécessite trois constructions transgéniques distinctes et n'est donc pas adapté pour des applications génétiques particulières. Récemment, une approche a été décrite dans lequel SUN (S ad1 et C-84 des Nations Unies) des protéines contenant le domaine qui localisent à la membrane interne de l'enveloppe nucléaire ont été marqués pardes protéines fluorescentes et exprimé sous le contrôle du système GAL4/UAS ^10. Les noyaux ont été isolés en présence d'un détergent non ionique pour enlever la membrane externe de l'enveloppe nucléaire, et purifié par affinité en utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps anti-GFP. Cette approche a été utilisée avec succès pour isoler de petites populations de noyaux marqués de sous-types de neurones spécifiques dans le cerveau adulte de Drosophila ^10.

Ici, un protocole d'isolement des noyaux marqués à partir d'une population mixte de cellules de Drosophila tissu larvaire est décrite. Cette méthode a été développée de façon indépendante, mais est similaire à l'approche décrite par Henry et al. ¹⁰ Tout d'abord, les noyaux ont été marqués avec un marqueur fluorescent qui est exprimé uniquement dans des types cellulaires spécifiques chez Drosophila melanogaster pour faciliter l'isolement subséquent de noyaux marqués de populations mixtes en utilisant une approche basée sur l'affinité. Pour marquer les noyaux,le domaine KASH (K larsicht / A nc-1 / S yne h omology) a été utilisé. Le domaine KASH est un domaine transmembranaire qui localise à la membrane externe de l'enveloppe nucléaire, en partie grâce à des interactions avec le soleil protéines contenant le domaine au sein de l'espace périnucléaire ^11. Le domaine de KASH C-terminale de protéines telles que Drosophila Msp-300 et Klarsicht ancre ces protéines de la membrane nucléaire externe, tandis que leurs domaines N-terminal d'interagir avec des protéines du cytosquelette telles que l'actine ou les microtubules dans le cytoplasme ^{de 12 à 14.} Les constructions ont été générées, dans lequel le domaine de Drosophila KASH Msp-300 a été fusionnée à l'extrémité C-terminale de l'EGFP, sous le contrôle de la séquence régulatrice de Gal4, UAS dans le vecteur pUAST-attB ^{15, 16.} Utilisation phiC31 intégration spécifique de site, les mouches transgéniques ont été générées, dans lequel les UAS-EGFP :: Msp-300 ^KASH transgène a été inséré dans le locus sur le chromosome attP23L ^17. Le SAMU-EGFP :: Msp-300 ^KASH vole peut être croisée avec les mouches qui expriment le pilote Gal4 dans un type cellulaire particulier, résultant dans l'expression ciblée de EGFP sur la membrane nucléaire externe dans le type cellulaire d'intérêt. Noyaux marqués peuvent ensuite être purifiés à partir de populations cellulaires mixtes utilisant des anticorps contre la GFP couplés à des billes magnétiques. Dans cette approche, l'utilisation d'un détergent non-ionique n'est pas nécessaire parce que la balise EGFP est localisée sur le côté cytoplasmique de la membrane nucléaire externe, et est donc accessible à des anticorps.

Le protocole décrit ci-dessous peut être utilisé pour isoler / enrichir noyaux EGFP marqué à partir de types de cellules spécifiques dans Drosophila tissus larvaires, pour quantifier la pureté et le rendement de noyaux isolés, et l'extrait d'ARN nucléaire approprié pour la transcription inverse couplée avec polymérase quantitative de la chaîne (qRT -PCR) Analyse de l'expression des gènes. L'isolement et la purification par affinité de noyaux (hors tissue dissection) peut être effectuée en moins d'une heure. Les résultats sont présentés montrant que les noyaux gliales peuvent être isolés avec succès à partir du lobe de l'optique et des larves disque imaginai de l'oeil, et utilisées pour l'analyse ultérieure de l'expression des gènes. Il est prévu que cette approche est utile pour l'isolement / enrichissement de noyaux marqués à partir de tissus embryonnaires et larvaires dans laquelle les cellules cibles constituent moins de 5% de la population globale. Tous les stocks de drosophile et les plasmides générées par cette étude sont disponibles auprès des auteurs sur demande.

Protocol

Une. Génération et caractérisation de EGFP :: KASH Drosophila Chauffeur de la Croix Gal4 vole au SAMU-EGFP :: Msp-300 KASH vole. Alternativement, les mouches recombinants qui portent à la fois le pilote Gal4 et le transgène UAS-EGFP :: Msp-300 KASH peuvent être générés en utilisant des techniques génétiques standard. Cette deuxième approche est avantageuse si un grand nombre de descendants sont nécessaires. Caractériser …

Representative Results

Le pilote repo-GAL4 (Bloomington stock number 7415) est spécifiquement exprimée dans les cellules gliales du système nerveux chez la drosophile à plusieurs stades de développement 18. Les mouches ont été générés qui expriment de manière stable SAMU-EGFP :: Msp-300 KASH sous le contrôle du pilote repo-GAL4 en utilisant des techniques génétiques standard. Afin de caractériser le profil d'expression de l'EGFP :: KASH transgène dans ces mouche…

Discussion

Ce protocole peut être utilisé pour isoler ou enrichir très précisément noyaux marqués de populations de cellules mixtes chez la drosophile embryonnaire ou tissus larvaires. En utilisant ce protocole, les noyaux peuvent être isolés à partir de tissus disséqués en environ 1 heure. La pureté et le rendement des noyaux isolés doivent être déterminés expérimentalement pour chaque type de cellule. Il peut être difficile de quantifier les noyaux de talon lié à l'étape de post-isolement du pro…

Materials

Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	mAB24B10
Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)	Roche	11814460001	This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.
2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX	MidSci	BEQPCR-R
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)	Biotium	40011
Dounce Homogenizer (1 ml)	VWR	62400-595
Dumont #5 Tweezers, 11 cm	World Precision Instruments	14095
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Invitrogen	10003D	This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.
EpiScript Reverse Transcriptase	Epicentre	ERT12910K	http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf
Falcon cell strainers, 40 μm pore size	VWR	21008-949	Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.
Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)	Millipore	LSKMAGS08
Mini tube rotator	Genemate	H-6700
Qubit starter kit	Life Technologies	Q32871	Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ
RNAsecure (Ambion)	Life Technologies	AM7010	The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.
RT-PCR machine Thermal Cycler	BioRad	CFX Connect Thermal Cycler
Siliconized 9 well glass plate	Hampton Research	HR3-134
Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 – 460nm) excitation + yellow barrier	Nightsea		This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)
StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand	Nikon	SMZ 745
Thermal Cycler	BioRad	T100
Trizol reagent	Life Technologies	15596018	CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf
Tween 20	Amresco	0777-1L