Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का प्रयोग जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच कर
Summary
प्रोटीन के बीच बातचीत सभी सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए मौलिक हैं. Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का उपयोग करना, प्रोटीन की एक जोड़ी के बीच बातचीत जीवित कोशिकाओं में और वास्तविक समय में निगरानी रखी जा सकती है. इसके अलावा, संभावित रोगजनक परिवर्तन के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है.
Abstract
Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) पर आधारित assays जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की निगरानी के लिए एक संवेदनशील और विश्वसनीय साधन प्रदान करते हैं. ब्रेट एक 'स्वीकर्ता' फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक 'दाता' luciferase एंजाइम से ऊर्जा के गैर विकरणशील हस्तांतरण है. इस परख का सबसे सामान्य विन्यास में, दाता Renilla reniformis luciferase है और स्वीकर्ता पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) है. ऊर्जा स्थानांतरण की क्षमता दृढ़ता से दूरी पर निर्भर है क्योंकि ब्रेट घटना का अवलोकन दाता और स्वीकर्ता पास में होने की आवश्यकता है. सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद के लिए परीक्षण करने के लिए, एक प्रोटीन luciferase और YFP के साथ एक संलयन के रूप में दूसरे के साथ एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है. ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद दाता और ऊर्जा स्थानांतरण होने के लिए पर्याप्त करीब स्वीकर्ता ला सकते हैं. में प्रोटीन, प्रोटीन की जांच के लिए अन्य तकनीकों की तुलनाteractions ब्रेट परख संवेदनशील है, छोटे हाथों पर समय और कुछ अभिकर्मकों की आवश्यकता है, और कमजोर क्षणिक, या एक जीवित कोशिका के भीतर पाया जैव रासायनिक वातावरण पर निर्भर हैं जो बातचीत का पता लगाने में सक्षम है. इसलिए यह खमीर दो संकर या मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स पढ़ाई ने सुझाव दिया ख्यात बातचीत की पुष्टि के लिए एक आदर्श तरीका है, और इसके अलावा यह प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर बाद translational संशोधनों के प्रभाव का आकलन करने, मानचित्रण बातचीत क्षेत्रों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और रोगी डीएनए में पहचान परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन.
Introduction
अनुक्रमण मानव विकारों का विश्लेषण करती है शास्त्रीय लिंकेज और अगली पीढ़ी के दोनों जैविक रास्ते की एक श्रेणी में शामिल प्रोटीन के नैदानिक प्रासंगिकता खुलासा कर रहे हैं. यह पहले इस तरह के अध्ययन में उनकी पहचान करने के लिए, इन प्रोटीनों की जैविक भूमिका का कम या कोई जांच हुई है, कि अक्सर मामला है. ब्याज की एक प्रोटीन की जैविक समारोह की खोज शुरू करने के लिए एक उपयोगी एवेन्यू इसे अपनी शारीरिक संदर्भ में आदान प्रदान के साथ अन्य जो प्रोटीन की पहचान करने के लिए है. इस फैशन में आणविक नेटवर्क निस्र्पक मानव phenotype अंतर्निहित जैविक रास्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.
सबसे अक्सर इस्तेमाल बड़े पैमाने पर प्रदर्शन ब्याज की प्रोटीन के लिए उम्मीदवार बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण खमीर दो संकर स्क्रीनिंग 1 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटिओमिक्स 2 हैं. इन तरीकों में संभावित बातचीत प्रोटीन सुझाव में बहुत सफल हो सकता है, लेकिन गिरफ्तारी कर सकते हैंझूठी सकारात्मक परिणाम की चपेट में ई. इसलिए, खमीर दो संकर या मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्क्रीनिंग द्वारा की पहचान एक बातचीत की पुष्टि एक दूसरी तकनीक का उपयोग कर बातचीत के सत्यापन की आवश्यकता है. आमतौर पर एक सह immunoprecipitation या पुल से नीचे परख इस उद्देश्य के 3 के लिए इस्तेमाल किया जाता है. सत्यापन के लिए इस तरह की तकनीक का उपयोग करने का एक नुकसान यह निश्चित प्रोटीन बातचीत को बनाए रखने के लिए आवश्यक हो सकता है कि intracellular शर्तों को नष्ट कर देता है, जो सेल, के लिए आवश्यकता है. एक दूसरा नुकसान यह है कि कमजोर या क्षणिक प्रोटीन बातचीत धोने चरणों के दौरान बाधित हो सकता है. इसके अलावा, इन assays, महत्वपूर्ण हाथों पर समय की मांग एक साथ कार्रवाई की जा सकती है कि नमूनों की संख्या में सीमित कर रहे हैं, और अक्सर अभिकर्मकों और प्रोटोकॉल का समय लेने वाली अनुकूलन की आवश्यकता है.
सह immunoprecipitation प्रयोगों से जुड़ी समस्याओं में से कुछ पर काबू पाने, कई assays फ्लोरोसेंट और biolum के आधार पर विकसित किया गया हैजीवित कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है कि inescent प्रोटीन. पहले इस तरह के assays प्रतिदीप्ति (या फोरस्टर) प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट), अतिव्यापी उत्सर्जन और उत्तेजना स्पेक्ट्रा 4 के साथ दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच ऊर्जा के गैर विकरणशील हस्तांतरण पर आधारित थे. ऊर्जा स्थानांतरण की क्षमता इसलिए झल्लाहट घटना का अवलोकन दाता और स्वीकर्ता fluorophores पास में होने की आवश्यकता है, दृढ़ता से दूरी पर निर्भर है. और स्वीकर्ता fluorophore (आमतौर पर पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन, YFP) के साथ एक संलयन के रूप में दूसरा, ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद के लिए परीक्षण करने के लिए, एक प्रोटीन दाता fluorophore (पाकिस्तानी सामान्यतः सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है. ब्याज की दो प्रोटीनों के बीच एक संवाद पाकिस्तानी दाता को YFP स्वीकर्ता रिश्तेदार से प्रकाश का उत्सर्जन में एक औसत दर्जे वृद्धि का परिणाम देगा, जो ऊर्जा के स्थानांतरण होने के लिए पर्याप्त करीब दाता और स्वीकर्ता fluorophores ला सकते हैं. एफआरएट जीवित कोशिकाओं 4 में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने में सफल रहा है. प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए झल्लाहट का उपयोग करने का मुख्य दोष दाता की fluorophore उत्तेजना के लिए बाहरी रोशनी के लिए आवश्यकता है. उत्सर्जन संकेत, स्वीकर्ता के अवांछित उत्तेजना, और दाता और स्वीकर्ता fluorophores दोनों की photobleaching में उच्च पृष्ठभूमि में बाहरी रोशनी का परिणाम है. इन प्रभावों को प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए परख की संवेदनशीलता को कम.
बाहरी रोशनी से उच्च पृष्ठभूमि की समस्या पर काबू पा जो झल्लाहट परख के एक संशोधन Bioluminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (ब्रेट) परख 5,6 है. ब्रेट प्रणाली में दाता fluorophore एक luciferase एंजाइम की जगह है. इस प्रकार स्वीकर्ता की fluorophore उत्तेजना के लिए ऊर्जा अनावश्यक बाहरी रोशनी प्रतिपादन, एक luciferase सब्सट्रेट के ऑक्सीकरण द्वारा प्रणाली के भीतर उत्पन्न होता है. अधिकांश मेंइस परख के आम विन्यास, दाता Renilla luciferase reniformis और स्वीकर्ता (वैकल्पिक दाता और स्वीकर्ता प्रोटीन की एक चर्चा के लिए Pfleger एट अल. 5 देखें) YFP है. तदनुसार, इस प्रणाली में, ब्याज की एक प्रोटीन luciferase और एक संभावित बातचीत प्रोटीन YFP के लिए, या ठीक इसके विपरीत से जुड़े हुए है. ब्रेट परख luciferase के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में coelenterazine का होना आवश्यक है. Coelenterazine सेल पारगम्य है, क्योंकि यह जीवित कोशिकाओं में ब्रेट assays के प्रदर्शन करने के लिए संभव है. हालांकि, देशी coelenterazine जलीय घोल में अस्थिर है, और coelenterazine के एंजाइम से स्वतंत्र टूटने परख के लिए उपलब्ध सब्सट्रेट की एकाग्रता कम कर देता है और luciferase गतिविधि की माप की संवेदनशीलता को कम कर देता है जो autoluminescence उत्पन्न दोनों. जीवित कोशिकाओं में ब्रेट के उपयोग जलीय घोल में स्थिर हैं लेकिन साइटोसोलिक esterase से चिपके रहते हैं, जो संरक्षित coelenterazines, के विकास के द्वारा सुविधा किया गया हैसेल 7 अंदर सक्रिय coelenterazine उत्पन्न करने के लिए कोशिका झिल्ली भर में प्रसार के बाद है.
Luciferase और YFP संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को सब्सट्रेट के अलावा के बाद, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत से उत्पन्न ऊर्जा हस्तांतरण luciferase और YFP से उत्सर्जन की निगरानी के द्वारा मात्रा निर्धारित है. प्रोटीन बातचीत बहु अच्छी तरह प्लेटें में जीवित कोशिकाओं में सीधे नजर रखी जा सकती क्योंकि ब्रेट परख लागत और समय कुशल है कि ख्यात बातचीत मान्य करने के लिए एक सरल, स्केलेबल विधि का गठन किया.
प्रोटिओमिक स्क्रीनिंग अध्ययन में पहचान की ख्यात interactors मान्य करने के अलावा, ब्रेट प्रणाली भी ब्याज की प्रोटीन पर पूर्व जैव रासायनिक और संरचनात्मक अध्ययन से उत्पन्न होने वाले परीक्षण के उम्मीदवार interactors करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अस्तित्व (ब्रेट परख का उपयोग करके या अन्य तकनीकों के द्वारा या तो) स्थापित किया गया है एक बार जब ब्रेट परख ईएमपी होने के लिए, वहाँ की क्षमता हैloyed आगे बातचीत करने के लिए चिह्नित. उदाहरण के लिए, बातचीत क्षेत्रों प्रोटीन का छोटा संस्करण उत्पन्न करके मैप किया जा सकता है, और बातचीत में विशिष्ट अवशेषों की भागीदारी बिंदु उत्परिवर्तन बनाकर प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर posttranslational संशोधनों या (जैसे दवाओं या ligands के रूप में) छोटे अणुओं की modulatory प्रभाव 8-10 जांच की जा सकती है.
ब्रेट परख भी रोगी डीएनए में पहचान म्यूटेशन की जांच के लिए काफी संभावना है. मामलों में एक परिवर्तन के लिए एक प्रेरणा भूमिका ब्रेट फेनोटाइप 11 की आणविक एटियलजि के बारे में अधिक प्रकट हो सकता है का उपयोग प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन, स्थापित किया गया है जहां. कई संभावित हानिकारक उत्परिवर्तन यह rele हैं जो स्पष्ट नहीं है जो मामले में, एक व्यक्ति के भीतर की पहचान की जा करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के तरीके के आगमन के बाद से, यह तेजी से सामान्य हैफेनोटाइप से 12 Vant. इस स्थिति में ब्रेट परख प्रोटीन समारोह पर परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन करने में मूल्यवान और विकार को इसलिए उनकी प्रासंगिकता हो सकती है.
Protocol
Representative Results
Discussion
संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति निर्माणों की डिजाइन ब्रेट परख स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में, ब्याज की प्रोटीन luciferase या YFP के सी टर्मिनस से इनकार कर रहे थे. यह भी संभव है, और lucifera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96 microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
References
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