La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Summary

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

Abstract

Los ensayos basados ​​en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) proporcionan un medio sensible y confiable para monitorear las interacciones proteína-proteína en las células vivas. BRET es la transferencia no radiativa de energía a partir de un "donante" de la enzima luciferasa a una proteína fluorescente aceptora. En la configuración más común de este ensayo, el donante es de la luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es proteína amarilla fluorescente (YFP). Debido a que la eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, la observación del fenómeno BRET requiere que el donante y aceptor de estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés en células de mamífero en cultivo, una proteína se expresa como una fusión con la luciferasa y la segunda como una fusión con YFP. Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar el donador y el aceptor suficientemente cerca para que se produzca la transferencia de energía. En comparación con otras técnicas para la investigación de la proteína-proteína eninteracciones, el ensayo BRET es sensible, requiere poca práctica en el tiempo y unos reactivos, y es capaz de detectar interacciones que son débiles, transitorio o dependiente del entorno bioquímico encontrado dentro de una célula viva. Por lo tanto, es un enfoque ideal para la confirmación de las interacciones putativas sugeridas por estudios de proteómica de levadura de dos híbridos o espectrometría de masas, y además es muy adecuado para cartografiar regiones interactuar, evaluar el efecto de las modificaciones post-traduccionales en las interacciones proteína-proteína, y evaluar el impacto de las mutaciones identificadas en el ADN del paciente.

Introduction

Tanto vinculación clásica y de próxima generación análisis de secuenciación de trastornos humanos están revelando la relevancia clínica de las proteínas que participan en una variedad de procesos biológicos. A menudo es el caso que, antes de su identificación en tales estudios, ha habido poca o ninguna investigación del papel biológico de estas proteínas. Una vía fructífera para comenzar a explorar la función biológica de una proteína de interés es identificar qué otras proteínas interactúa con en su contexto fisiológico. Caracterización de las redes moleculares de esta manera proporciona información detallada sobre los procesos biológicos que subyacen al fenotipo humano.

La proyección a gran escala de uso más frecuente se acerca para la identificación de los compañeros de interacción candidatos para las proteínas de interés son la levadura de dos híbridos de ¹ y proteómica basada en la espectrometría de masas ^2. Estos métodos pueden ser muy exitosos en lo que sugiere que interactúan las proteínas potenciales, pero are vulnerable a resultados positivos falsos. Por lo tanto, la confirmación de una interacción identificado por levadura de la espectrometría de masas de dos híbridos o requiere la validación de la interacción utilizando una segunda técnica. Normalmente, un co-inmunoprecipitación o ensayo de pull-down se utiliza para este fin ^3. Una desventaja del uso de tales técnicas para la validación es el requisito para la lisis celular, que destruye las condiciones intracelulares que pueden ser esenciales para el mantenimiento de ciertas interacciones proteína. Una segunda desventaja es que las interacciones débiles o transitorios de proteína pueden ser interrumpidos durante los pasos de lavado. Además, estos ensayos exigen práctica en tiempo significativos, están limitados en el número de muestras que se pueden procesar de forma simultánea, y a menudo requieren la optimización de tiempo de los reactivos y protocolos.

Para superar algunos de los problemas asociados con experimentos de co-inmunoprecipitación, varios ensayos se han desarrollado sobre la base de fluorescente y bioluminescent proteínas que se pueden utilizar en células vivas. El primero de estos ensayos se basan en la fluorescencia (o Förster) Transferencia de energía de resonancia (FRET), la transferencia no radiante de energía entre dos proteínas fluorescentes con la superposición de espectros de emisión y de excitación ^4. La eficiencia de la transferencia de energía es fuertemente dependiente de la distancia, por lo tanto, la observación del fenómeno de FRET requiere que los fluoróforos donador y aceptor estar en estrecha proximidad. Para la prueba de una interacción entre dos proteínas de interés, una proteína se expresa como una fusión con el fluoróforo donante (proteína fluorescente cian comúnmente; PPC) y el segundo como una fusión con el fluoróforo aceptor (proteína fluorescente amarilla comúnmente; YFP). Una interacción entre las dos proteínas de interés puede llevar a los donantes y aceptor fluoróforos suficientemente próximos para que se produzca la transferencia de energía, lo que resultará en un aumento mensurable en la emisión de luz desde el aceptor YFP en relación con el donante de la PPC. FRET ha tenido éxito en la detección de interacciones proteína-proteína en células vivas ^4. El principal inconveniente del uso de FRET para la detección de interacciones proteína-proteína es el requisito para la iluminación externa para la excitación del fluoróforo donante. Resultados de la iluminación interior en gran fondo en la señal de emisión, excitación no deseada del aceptante, y fotoblanqueo del donante y aceptor fluoróforos. Estos efectos reducen la sensibilidad del ensayo para la detección de interacciones proteína-proteína.

Una modificación del ensayo de FRET, que supera el problema de alto fondo de la iluminación externa es la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) ^5,6 ensayo. En el sistema de BRET el fluoróforo donante se sustituye por una enzima luciferasa. Así, la energía para la excitación del fluoróforo aceptor se genera dentro del sistema por la oxidación de un sustrato de luciferasa, lo que hace innecesaria la iluminación externa. En el másconfiguración común de este ensayo, el donante es luciferasa de Renilla reniformis y el aceptor es YFP (para una discusión de la alternativa de donantes y aceptores de proteínas ver Pfleger et al. ^5). De acuerdo con ello, en este sistema, una proteína de interés se fusiona con una proteína luciferasa y potencialmente interactuar a YFP, o viceversa. El ensayo BRET requiere la adición de coelenterazina como sustrato para la luciferasa. Debido a que la coelenterazina es permeable a las células, es posible llevar a cabo ensayos de BRET en células vivas. Sin embargo, coelenterazina nativa es inestable en solución acuosa, y el desglose-enzima independiente de coelenterazina tanto reduce la concentración de sustrato disponible para el ensayo y genera autoluminiscencia, lo que reduce la sensibilidad de las mediciones de la actividad de luciferasa. El uso de BRET en células vivas ha sido facilitado por el desarrollo de coelenterazines protegidas, que son estables en solución acuosa, pero se escinden por esterasas citosólicass después de la difusión a través de la membrana de la célula para generar coelenterazina activo dentro de la célula ^7.

Después de la adición de sustrato a las células que expresan luciferasa y las proteínas de fusión-YFP, la transferencia de energía resultante de las interacciones proteína-proteína se cuantificó mediante el control de la emisión de la luciferasa y YFP. Debido a las interacciones de proteínas se pueden monitorizar directamente en células vivas en placas de múltiples pocillos, el ensayo BRET constituye un método simple y escalable para la validación de las interacciones putativo que es el costo y eficiente en el tiempo.

Además de validar interactores putativos identificados en estudios de cribado proteómicos, el sistema de BRET también se puede utilizar para candidatos a elementos interactuantes prueba de derivados de estudios bioquímicos y estructurales previas sobre la proteína de interés. Una vez que la existencia de una interacción proteína-proteína se ha establecido (ya sea usando el ensayo BRET o por otras técnicas), existe un potencial para el ensayo BRET para ser EMPLoyed más para caracterizar la interacción. Por ejemplo, las regiones que interactúan se pueden asignar mediante la generación de versiones truncadas de las proteínas, y la participación de residuos específicos en la interacción se puede demostrar mediante la creación de mutaciones puntuales. Además, el efecto modulador de modificaciones postraduccionales o pequeñas moléculas (tales como fármacos o ligandos) sobre las interacciones proteína-proteína puede ser investigado ^8-10.

El ensayo BRET también tiene un gran potencial para la investigación de mutaciones identificadas en el ADN del paciente. En los casos en que se ha establecido un papel causal para una mutación, estudiar el efecto de la mutación en las interacciones proteína-proteína utilizando BRET puede revelar más acerca de la etiología molecular de la fenotipo ^11. Desde el advenimiento de las metodologías de secuenciación de próxima generación, cada vez es más común para varias mutaciones potencialmente dañinos que se identifiquen dentro de un individuo, en cuyo caso no está claro cuáles son releVant para el fenotipo ^12. En esta situación el ensayo BRET puede ser valiosa en la evaluación del impacto de las mutaciones en la función de las proteínas y, por tanto, su importancia para el trastorno.

Protocol

1. Creación de plásmidos Subclonar el ADNc para cada proteína de interés en ambos los vectores pluc y pYFP, ​​utilizando técnicas estándar de biología molecular (Figura 1). Para ver protocolos detallados Green et al 13. Secuencia de todos los constructos para verificar que las proteínas de interés están en marco con la secuencia de Luc / YFP sin codones de parada intermedios. Realizar ensayos funcionales como se desee para confirmar que la…

Representative Results

El principio del ensayo BRET se ilustra en la Figura 2. La configuración de ensayo utilizado a través de los experimentos presentados aquí se representa en la figura 3. La detección de una señal BRET fuerte a partir de células transfectadas con una proteína de fusión luciferasa-YFP confirmó que la transferencia de energía era observable en este montaje experimental (Figura 4). Nuestra investigación se centra en el papel de la fami…

Discussion

El diseño de las construcciones de expresión de la proteína de fusión es un paso fundamental en la creación del ensayo BRET. En los experimentos presentados aquí, las proteínas de interés se fusionan con el extremo C-terminal de la luciferasa o YFP. También es posible, y puede ser necesario, para fusionar proteínas a la N-terminal de luciferasa / YFP. Para algunas proteínas, las fusiones sólo podrán aceptarse en el extremo N-o C-terminal con el fin de evitar la interrupción de la estructura y función de p…

Materials

Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96 microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.