Intrastriatal Injektion af autologt blod eller Clostridial Collagenase som murine modeller af intracerebral blødning

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

Intracerebral blødning (ICH) er en almindelig form af cerebrovaskulær sygdom, og er forbundet med betydelig morbiditet og mortalitet. Mangel på effektiv behandling og svigt af store kliniske forsøg med henblik på hæmostase og blodprop fjernelse demonstrere behovet for yderligere mekanisme drevet undersøgelse af ICH. Denne forskning kan udføres gennem de rammer, som prækliniske modeller. To murine modeller i populære brug omfatter intrastriatal (basalganglierne) injektion af enten autolog fuldblod eller Clostridium collagenase. Da hver model repræsenterer klart forskellige patofysiologiske funktioner i forbindelse med ICH kan vælges anvendelse af en bestemt model, baseret på, hvad aspekt af sygdommen, der skal undersøges. For eksempel autologt blod injektion mest nøjagtigt repræsenterer hjernens reaktion på tilstedeværelsen af ​​intraparenchymal blod, og kan bedst replikere lobar blødning. Clostridialt collagenase injektion mest præcist repræsenterer de sindkøbscenter fartøj brud og hæmatom evolution karakteristisk for dybe blødninger. Således hver modelresultater i forskellige hæmatom dannelse, neuroinflammatoriske svar, hjerneødem udvikling og neurobehavioral resultater. Robusthed af en påstået terapeutisk intervention kan bedst vurderes ved hjælp af begge modeller. I denne protokol, er induktion af ICH med begge modeller, øjeblikkelig postoperativ demonstration af skade, og tidlige postoperative pleje teknikker demonstreret. Begge modeller resulterer i reproducerbare skader, hæmatom mængder og neurobehavioral underskud. På grund af heterogenitet menneskelig ICH, er der behov for flere prækliniske modeller til grundigt at undersøge patofysiologiske mekanismer og afprøve mulige terapeutiske strategier.

Introduction

Intracerebral blødning (ICH) er en forholdsvis almindelig form for cerebrovaskulær sygdom med ca 40-50% af ramte patienter dør inden for 30 dage ^1. Desværre er en lille forbedring er sket i dødeligheden i de sidste 20 år ^2. Rapporter fra National Institutes of Health ³ og retningslinjer fra American Heart Association ⁴ understregede vigtigheden af at udvikle klinisk relevante modeller af ICH til at udvide forståelsen af patofysiologien og udvikle mål for nye terapeutiske tilgange.

Flere modeller eksisterer for at efterligne menneskelige ICH ^5. Som forståelse af ICH patofysiologi modnes, er det blevet klart, at en bred vifte af modeller, kan benyttes til at undersøge forskellige aspekter af sygdommen. Tidligere anvendte modeller omfatter murine amyloidangiopati ^6, intraparenchymal mikroballonsfyldstof isætning og inflation ⁷ og direkte arterieblodinfiltration ^8,9. Lobar blødning fra amyloidangiopati er modelleret med anvendelsen af ​​transgene mus og udgør en særskilt ICH subtype. Mikroballonsfyldstof modeller efterligne akut masse fra dannelse af hæmatomer, men undlader at fange hjernens cellulære respons på tilstedeværelsen af ​​blod. Endelig direkte arteriel blod infiltration udsætter hjernen til arterielle pres fra den femorale arterie. Således Denne model efterligner arterielle tryk og tilstedeværelsen af ​​blod, men ikke udsætte hjernen til mikrovaskulære skader fra små blodkar brud. Endvidere har denne model i sagens natur stor variation. Interessant, spontant hypertensive rotter ¹⁰ udvikle spontan ICH som de bliver ældre. Undersøgelse af disse dyr efter ICH udvikling kan efterligne sygdommen i overværelse af en af ​​de store følgesygdomme som disponerer mennesker til ICH. Selv om disse andre modeller findes, intrastriatal injektion af Clostridium collagenase ¹¹ eller instrastiatal injektion af enutologous fuldblod ¹² er, i øjeblikket, bruges de to mest almindelige modeller i præklinisk ICH forskning.

ICH model udvælgelse bør ske på grundlag af formålet med den eksperimentelle spørgsmål, herunder arter udvælgelse og fremgangsmåde til at inducere dannelse af hæmatomer. For eksempel grise er store dyr med relativt store hvide substans i hjernen mængder sammenlignet med mus. Således er grisemodeller velegnet til at studere hvide substans patofysiologi efter hjerneblødning. I modsætning hertil hjerner gnaver er stort set grå materie, men transgene systemer gør gnavere nyttigt at vurdere molekylære mekanismer for skade og bedring efter hjerneblødning. Hver model har sine iboende styrker og svagheder (tabel 1), som bør overvejes nøje, før eksperimenter.

Følgende protokoller demonstrere de autologe blod og collagenase injektion modeller i mus. Disse modeller har hver især blevet oversat fra modeller, der oprindeligt er udviklet i rotter^13,14 og tillade anvendelse af almindeligt tilgængelige transgen teknologi til at udforske molekylære mekanismer, der er forbundet med celledød efter hjerneblødning. Begge repræsenterer klart forskellige skade mekanismer fra menneskelig ICH, og begge har tydeligt forskellige udfald forventede i form af adfærdsmæssige og histologiske foranstaltninger. Således kan visse hypoteser egner sig til én model frem for den anden, men mange ideer kan kræve validering i begge modeller.

Tabel 1.. Sammenligning af karakteristika collagenase-og autologe blod injektion intracerebral blødning modeller.

<tr>

	Collagenase Injektion	Blood Injektion
Brugervenlighed	+ + +	+ +
Reproducerbarhed	+ +	+ +
Kontrol af Blødninger Størrelse	+ +	+ + +
Blood Refluks	+	+ +
Simulerer menneskelig sygdom	+	–
Enkelhed	+ +	+ +
Anvendelse i flere arter,	+ +	+ +

Protocol

Etik Erklæring: Denne protokol er blevet godkendt af Duke University Institutional Animal Care og brug Udvalg og følger alle retningslinjer for etisk brug af dyr. 1.. Forberedelse af udstyr Autoklaver de kirurgiske værktøjer forud for operationen. Desinficer stereotaktisk apparat med 70% ethanol. Tænd vandbad og holde vandtemperaturen ved 42 ° C. Opløs Type IV-S klostridial kollagenase i normalt saltvand i en koncentration på 0,075 U pr 0.4 pi…

Representative Results

Grund af forskelle i hæmatom dannelse (figur 1), er ipsilateral drejning vises umiddelbart efter vågne op til autolog blod injicerede mus og inden 2 – 4 timer efter collagenase injektion, som hæmatom ekspansion forekommer (figur 2). Fravær af ipsilateral drejning bør rejse bekymring for mangel på væsentlig skade. På det første indlæg skade dag, bør mus i begge modeller demonstrere væsentlige neurologiske underskud (Figur 3). På 24 timer efter injektion, ips…

Discussion

Trods nye prækliniske forskning og deraf følgende store kliniske forsøg for lovende lægemidler ^15-18, er der ingen farmakologiske interventioner vist sig at forbedre resultatet i ICH, og pleje er stadig stort set støttende. Lister over mulige behandlinger kan genereres ved high throughput teknologier, såsom transkriptom og proteom arbejde. Mens disse teknologier fortsætter med at fremme vores viden af potentielle terapeutiske mål, frem og tilbage oversættelse af lovende mål kan bedst undersøges gen…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 µl Hamilton syringe	Hamilton Co.	86259	25 gauge needle
50 µl Hamilton syringe	Hamilton Co	7637-01
26G Hamilton needle	Hamilton Co	7804-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20-gauge, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE20	Becton-Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
30G 1 inch needle	Becton-Dickinson	305128
27G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD