הזרקת Intrastriatal של עצמי בדם או קלוסטרידיאל Collagenase כמודלים Murine של Intracerebral שטף דם
Summary
Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.
Abstract
דימום תוך מוחי (ICH) הוא צורה נפוצה של מחלת כלי דם במוח והיא קשורה עם תחלואה ותמותה משמעותיות. חוסר טיפול ואי יעילים של ניסויים קליניים הגדולים שמטרתו עצירת דימום והסרת קריש להדגים את הצורך בחקירה מונחה מנגנון נוספת של ICH. מחקר זה עשוי להתבצע דרך המסגרת הניתנת על ידי מודלים פרה. שני מודלים עכבריים בשימוש פופולרי כוללים הזרקת intrastriatal (גרעיני בסיס) של או דם כולו עצמי או collagenase קלוסטרידיאל. מאז, כל דגם מייצג תכונות pathophysiological שונות במובהק קשורים לICH, שימוש בדגם מסוים ניתן לבחור על סמך מה היבט של המחלה היא כדי להיחקר. לדוגמא, הזרקת דם עצמית באופן מדויק ביותר מייצגת תגובה של המוח לנוכחות של דם intraparenchymal, ועשויה לשכפל דימום אונים באופן הדוק ביותר. הזרקת collagenase קלוסטרידיאל מייצגת באופן מדויק ביותר שלקרע כלי קניון ואופייני התפתחות שטף דם של שטפי דם עמוקים. לפיכך, כל תוצאות מודל במבנה שונה שטף דם, תגובת neuroinflammatory, פיתוח בצקת מוחי, ותוצאות neurobehavioral. חוסנה של התערבות טיפולית כביכול ניתן להעריך הטוב ביותר באמצעות שני המודלים. בפרוטוקול זה, אינדוקציה של ICH שימוש בשתי המודלים, הפגנה שלאחר ניתוח מיידית של פציעה, וטכניקות טיפול שלאחר ניתוח הראשונה הם הפגינו. שני הדגמים לגרום לפציעות לשחזור, כרכי שטף דם, וגירעונות neurobehavioral. בגלל חוסר האחידות של ICH אדם, יש צורך במודלים פרה מרובים כדי לחקור ביסודיות מנגנוני pathophysiologic ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
Introduction
דימום תוך מוחי (ICH) הוא צורה נפוצה יחסית של מחלת כלי דם במוח בכ 40-50% מהחולים נגועים למות בתוך 30 ימים 1. למרבה הצער, שיפור מועט נעשה בשיעור התמותה מעל 20 השנים האחרונות 2. דיווחים מהמכון הלאומי לבריאות 3 והנחיות מהלב האמריקאי 4 האיגוד הדגישו את החשיבות של פיתוח מודלים רלוונטיים קליני של ICH להאריך את ההבנה של הפתופיזיולוגיה ולפתח מטרות לגישות טיפוליות חדשות.
מספר דגמים קיימים לחקות ICH אדם 5. ככל שהבנה של מתבגרת הפתופיזיולוגיה ICH, זה הפך להיות ברור כי מגוון רחב של דגמים ניתן להשתמש כדי לבחון את ההיבטים שונים של המחלה. מודלים ששמשו בעבר כוללים angiopathy העכברי עמילואיד 6, כניסה microballoon intraparenchymal ואינפלציה 7, ודם עורקים ישירהחדירה 8,9. דימום אונים מangiopathy עמילואיד כבר דגם עם השימוש בעכברים הטרנסגניים ומייצג תת סוג ICH מובחן. מודלים Microballoon לחקות אפקט מסה חריף מהיווצרות שטף דם אבל לא מצליחים ללכוד תגובה התאית של המוח לנוכחות של דם. לבסוף, חדירת דם עורקים ישירה מכפיפה את המוח לחצים עורקים מעורק הירך. לפיכך, לחצים זה מחקה מודל העורק ואת הנוכחות של דם, אך לא תחשוף את המוח לפגיעה כלי הדם מקרע של כלי דם קטן. יתר על כן, מודל זה יש גבוה מיסודו השתנות. מעניין לציין, כי חולדות עם יתר לחץ דם באופן ספונטני 10 לפתח ICH ספונטני כשהם מזדקנים. מחקר של בעלי חיים אלה לאחר פיתוח ICH יכול לחקות את המחלה בנוכחותו של אחד מהתחלואות הגדולות predisposing בני אדם לICH. בעוד מודלים אחרים אלה קיימים, הזרקת intrastriatal של collagenase קלוסטרידיאל 11 או הזרקת instrastiatal שלדם כל utologous 12 הם, כיום, שני המודלים הנפוצים ביותר בשימוש במחקר קליני ICH.
בחירה במודל ICH צריכה להתבצע על בסיס האובייקטיבי של שאלת הניסוי, כוללים בחירת זנים ושיטה של גרימת היווצרות שטף דם. לדוגמא, חזירים הם בעלי חיים גדולים עם נפח מוח חומר הלבן גדול יחסית בהשוואה לעכברים. לפיכך, מודלים חזיריים מתאימים ללמוד הפתופיזיולוגיה חומר לבנה לאחר ICH. בניגוד לכך, המוח של מכרסמים הם במידה רבה עניין אפור, אבל מערכות מהונדסים לעשות מכרסמים שימושיים כדי להעריך את המנגנונים מולקולריים של פגיעה והתאוששות לאחר ICH. לכל דגם עוצמות הטבועות בו וחולשות (טבלה 1), אשר יש לשקול בזהירות לפני ניסויים.
הפרוטוקולים הבאים להדגים את המודלים דם והזרקת collagenase עצמיים בעכברים. מודלים אלה כל תורגמו ממודלים שפותחו במקור בחולדות13,14 ולאפשר את השימוש בטכנולוגיה מהונדס זמינה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הקשורים למוות של תאים לאחר ICH. שניהם מייצגים מנגנוני פציעה שונים במובהק מICH האנושי, ושניהם יש תוצאה צפויה שונה במובהק במונחים של מדדים התנהגותיים והיסטולוגית. לפיכך, השערות מסוימות עשויות להשאיל את עצמם למודל אחד על פנים השני, אך רעיונות רבים עשויים לדרוש אימות בשני המודלים.
טבלת 1. השוואה של מאפיינים של collagenase ודגמי דימום עצמיים הזרקת דם תוך מוחיים.
| הזרקת Collagenase | הזרקת דם | |
| קלות השימוש | + + + | + + | שחזור | + + | + + |
| שליטה על גודל שטף דם | + + | + + + |
| Reflux דם | + | + + |
| מדמה מחלה אנושית | + | – |
| פשטות | + + | + + |
| השתמש במינים רבים | + + | + + |
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות מתעורר מחקר קליני וניסויים קליניים גדולים שנוצר למבטיח הרפוי 15-18, אין התערבויות תרופתי הפגינו כדי לשפר את התוצאה בICH, וטיפול נשאר במידה רבה תומך. רשימות של טיפולים אפשריים עשויות להיות שנוצרו על ידי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, כגון עבודת transcriptomic וproteomic. בעוד ט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the American Heart Association Scientist Development Grant and the Foundation for Anesthesia Education and Research (MLJ). We would like to thank Talaignair N. Venkatraman PhD for his assistance with magnetic resonance imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | 51603 | |
| Probe holder with corner clamp | Stoelting Co. | 51631 | |
| Mini grinder | Power Glide | Model 60100002 | |
| 0.5 µl Hamilton syringe | Hamilton Co. | 86259 | 25 gauge needle |
| 50 µl Hamilton syringe | Hamilton Co | 7637-01 | |
| 26G Hamilton needle | Hamilton Co | 7804-03 | |
| Syringe pump | KD Scientific | Model 100 | |
| Heat therapy water pump | Gaymar Industries, Inc. | Model# TP650 | |
| Circulating waterbed | CMS Tool & Die, Inc. | ||
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | Model 683 | |
| Isoflurane vaporizer | Drager | Vapor 19.1 | |
| Air flowmeter | Cole Parmer | Model PMR1-010295 | |
| Induction chamber | Self made | ||
| Otoscope | Welch Allyn | 22820 | |
| intravenous catheter | Becton-Dickinson | 381534 | 20-gauge, 1.16 inch Insyte-W |
| Isoflurane | Baxter Healthcare Corporation | NDC10019-360-69 | |
| Collagenase Type IV-S | Sigma | C1889 | |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton-Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton-Dickinson | 427401 | |
| 30G 1 inch needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| 27G 1 1/4 inch needle | Becton-Dickinson | 305136 | |
| Surgical scissors | Miltex | 21-539 | |
| Forceps | Miltex | 17-307 | |
| Needle holder | Boboz | RS-7840 | |
| Monofilament suture | Ethicon | 8698 | Size 5-0 |
| Indicating controller | YSI | 73ATD |
References
- Asch, C. J., et al. Incidence, case fatality, and functional outcome of intracerebral haemorrhage over time, according to age, sex, and ethnic origin: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurology. 9, 167-176 (2010).
- Qureshi, A. I., Mendelow, A. D., Hanley, D. F. Intracerebral haemorrhage. Lancet. 373, 1632-1644 (2009).
- Participants, N. I. W. Priorities for clinical research in intracerebral hemorrhage: report from a National Institute of Neurological Disorders and Stroke workshop. Stroke. 36, (2005).
- Morgenstern, L. B., et al. Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 41, 2108-2129 (2010).
- James, M. L., Warner, D. S., Laskowitz, D. T. Preclinical models of intracerebral hemorrhage: a translational perspective. Neurocrit Care. 9, 139-152 (2008).
- Winkler, D. T., et al. Spontaneous hemorrhagic stroke in a mouse model of cerebral amyloid angiopathy. J Neurosci. 21, 1619-1627 (2001).
- Sinar, E. J., Mendelow, A. D., Graham, D. I., Teasdale, G. M. Experimental intracerebral hemorrhage: effects of a temporary mass lesion. J Neurosurg. 66, 568-576 (1987).
- Mendelow, A. D., Bullock, R., Teasdale, G. M., Graham, D. I., McCulloch, J. Intracranial haemorrhage induced at arterial pressure in the rat. Part 2: Short term changes in local cerebral blood flow measured by autoradiography. Neurol Res. 6, 189-193 (1984).
- Bullock, R., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M., Graham, D. I. Intracranial haemorrhage induced at arterial pressure in the rat. Part 1: Description of technique, ICP changes and neuropathological findings. Neurol Res. 6, 184-188 (1984).
- Sang, Y. H., Su, H. X., Wu, W. T., So, K. F., Cheung, R. T. Elevated blood pressure aggravates intracerebral hemorrhage-induced brain injury. J Neurotrauma. 28, 2523-2534 (2011).
- Krafft, P. R., et al. Modeling intracerebral hemorrhage in mice: injection of autologous blood or bacterial collagenase. J Vis Exp. , (2012).
- Sansing, L. H., et al. Autologous blood injection to model spontaneous intracerebral hemorrhage in mice. J Vis Exp. , (2011).
- Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21, 801-807 (1990).
- Nath, F. P., Jenkins, A., Mendelow, A. D., Graham, D. I., Teasdale, G. M. Early hemodynamic changes in experimental intracerebral hemorrhage. J Neurosurg. 65, 697-703 (1986).
- Anderson, C. S., et al. Rapid blood-pressure lowering in patients with acute intracerebral hemorrhage. N Engl J Med. 368, 2355-2365 (2013).
- Clark, W., Gunion-Rinker, L., Lessov, N., Hazel, K. Citicoline treatment for experimental intracerebral hemorrhage in mice. Stroke. 29, 2136-2140 (1998).
- Mayer, S. A., et al. Efficacy and safety of recombinant activated factor VII for acute intracerebral hemorrhage. N Engl J Med. 358, 2127-2137 (2008).
- Mendelow, A. D., et al. Early surgery versus initial conservative treatment in patients with spontaneous supratentorial lobar intracerebral haematomas (STICH II): a randomised trial. Lancet. , (2013).
- James, M. L., Blessing, R., Bennett, E., Laskowitz, D. T. Apolipoprotein E modifies neurological outcome by affecting cerebral edema but not hematoma size after intracerebral hemorrhage in humans. J Stroke Cerebrovasc Dis. 18, 144-149 (2009).
- James, M. L., Blessing, R., Phillips-Bute, B. G., Bennett, E., Laskowitz, D. T. S100B and brain natriuretic peptide predict functional neurological outcome after intracerebral haemorrhage. Biomarkers. 14, 388-394 (2009).
- James, M. L., Sullivan, P. M., Lascola, C. D., Vitek, M. P., Laskowitz, D. T. Pharmacogenomic effects of apolipoprotein e on intracerebral hemorrhage. Stroke. 40, 632-639 (2009).
- James, M. L., et al. Brain natriuretic peptide improves long-term functional recovery after acute CNS injury in mice. J Neurotrauma. 27, 217-228 (2010).
- Indraswari, F., et al. Statins improve outcome in murine models of intracranial hemorrhage and traumatic brain injury: a translational approach. J Neurotrauma. 29, 1388-1400 (2012).
- Laskowitz, D. T., et al. The apoE-mimetic peptide, COG1410, improves functional recovery in a murine model of intracerebral hemorrhage. Neurocrit Care. 16, 316-326 (2012).
- Lei, B., et al. Interaction between sex and apolipoprotein E genetic background in a murine model of intracerebral hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. J Neurosurg. 118, 465-477 (2013).
- Nakamura, T., et al. Intracerebral hemorrhage in mice: model characterization and application for genetically modified mice. J Cereb Blood Flow Metab. 24, 487-494 (2004).
- Yang, D., et al. Statins Protect the Blood Brain Barrier Acutely after Experimental Intracerebral Hemorrhage. J Behav Brain Sci. 3, 100-106 (2013).
- Rynkowski, M. A., et al. A mouse model of intracerebral hemorrhage using autologous blood infusion. Nature Protocols. 3, 122-128 (2008).
- Wang, J., Fields, J., Dore, S. The development of an improved preclinical mouse model of intracerebral hemorrhage using double infusion of autologous whole blood. Brain Research. 1222, 214-221 (2008).
- MacLellan, C. L., et al. Intracerebral hemorrhage models in rat: comparing collagenase to blood infusion. J Cereb Blood Flow Metab. 28, 516-525 (2008).
