Intrastriatal Injektion av autologt blod eller Clostridial kollagenas som musmodeller av intracerebral blödning

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

Intracerebral blödning (ICH) är en vanlig form av cerebrovaskulär sjukdom och förknippas med betydande morbiditet och mortalitet. Brist på effektiv behandling och misslyckande av stora kliniska studier som syftar till hemostas och koagulera borttagning visar behovet av ytterligare mekanism driven utredning av ICH. Denna forskning kan utföras genom den ram som prekliniska modeller. Två musmodeller i populär användning inkluderar intrastriatal (basala ganglierna) injektion av antingen autologt helblod eller clostridial kollagenas. Eftersom representerar varje modell helt olika patofysiologiska funktioner som är relaterade till ICH, kan väljas användning av en viss modell som bygger på vilken aspekt av sjukdomen är att studeras. Till exempel autologt blod injektion representerar mest korrekt hjärnans svar på närvaron av intraparenkymal blod, och kan närmast replikera lobära blödning. Clostridial kollagenas injektion representerar de mest noggrantgalleria kärl bristning och hematom evolution karakteristisk för djupa blödningar. Således varje modell resulterar i olika hematom, neuroinflammatoriska respons, cerebralt ödem utveckling och neurobehavioral resultat. Robusthet av en påstådd terapeutisk intervention kan bedömas bäst med båda modellerna. I detta protokoll, är induktion av ICH med båda modellerna, omedelbara postoperativa demonstration av skada, och tidiga postoperativa vårdteknik demonstreras. Båda modellerna resulterar i reproducerbara skador, hematom volymer och neurobehavioral underskott. På grund av den heterogena mänskliga ICH, finns flera prekliniska modeller som krävs för att grundligt undersöka patofysiologiska mekanismer och testa potentiella terapeutiska strategier.

Introduction

Intracerebral blödning (ICH) är en relativt vanlig form av cerebrovaskulär sjukdom med cirka 40-50% av drabbade patienter som dör inom 30 dagar ^1. Tyvärr har liten förbättring skett i dödligheten under de senaste 20 åren ^2. Rapporter från National Institutes of Health ³ och riktlinjer från American Heart Association ⁴ betonade vikten av att utveckla kliniskt relevanta modeller av ICH att utöka förståelsen av patofysiologi och utveckla mål för nya terapeutiska metoder.

Flera modeller finns för att efterlikna den mänskliga ICH ^5. Som förståelse för ICH patofysiologi mognar, har det blivit uppenbart att en mängd olika modeller kan användas för att undersöka olika aspekter av sjukdomen. Tidigare använda modeller inkluderar murina amyloid angiopati ^6, intraparenkymal mikroballonger insättning och inflationen ^7, och direkt arteriellt blodinfiltration ^8,9. Lobar hemorragi från amyloidangiopati har modellerats med användning av transgena möss och representerar en distinkt ICH undertyp. Mikroballonger modeller härma akut masseffekt från hematombildning men misslyckas med att fånga hjärnans cellulära svar på närvaron av blod. Slutligen utsätter direkt arteriellt blod infiltration hjärnan till artärtryck från lårbensartären. Således innebär denna modell härmar artärtryck och förekomst av blod men inte utsätta hjärnan för mikrovaskulära skador från små blodkärl brista. Vidare har denna modell inneboende hög variabilitet. Intressant, spontant hypertensiva råttor ¹⁰ utvecklar spontan ICH som de gamla. Studie av dessa djur efter ICH utveckling kan efterlikna sjukdomen i närvaro av en av de stora sjukdomstillstånd som predisponerar människor till ICH. Även om dessa andra modeller finns, intrastriatal injektion av Clostridial kollagenas ¹¹ eller instrastiatal injektion av enutologous helblod ¹² är, för närvarande, de två vanligaste modellerna som används inom preklinisk ICH forskning.

ICH modellval bör göras utifrån syftet med den experimentella frågan, inklusive val av arter och metod för att framkalla hematom. Till exempel grisar är stora djur med relativt stora vita substansen i hjärnan volymer jämfört med möss. Således är svin modeller lämpade för att studera vita substansen patofysiologi efter ICH. Däremot gnagare hjärnor är i stort sett grå substans, men transgena system gör gnagare lämpligt att utvärdera molekylära mekanismer för skada och återhämtning efter ICH. Varje modell har sina inneboende styrkor och svagheter (tabell 1), som bör övervägas noga innan experiment.

Följande protokoll visar de autologa blod och kollagenas injektion modeller i möss. Dessa modeller har var och översatts från modeller som ursprungligen utvecklats i råttor^13,14 och tillåta användning av allmänt tillgängliga transgen teknik för att undersöka molekylära mekanismer som förknippas med celldöd efter ICH. Båda representerar helt olika skademekanismer från mänsklig ICH, och båda har helt olika förväntade utfallet i termer av beteende-och histologiska åtgärder. Således kan vissa hypoteser lämpar sig för en modell över den andra, men många idéer kan kräva godkännande i båda modellerna.

Tabell 1. Jämförelse av egenskaper hos kollagenas-och autologa blod injektion intracerebral blödning modeller.

<tr>

	Kollagenas Injektion	Blod Injektion
Lättanvänd	+ + +	+ +
Reproducerbarhet	+ +	+ +
Kontroll av blödning Storlek	+ +	+ + +
Blod Reflux	+	+ +
Simulerar Human Disease	+	–
Enkelhet	+ +	+ +
Användning i flera arter	+ +	+ +

Protocol

Etik uttalande: Detta protokoll har godkänts av Duke University Institutional Animal Care och användning kommittén och följer alla riktlinjer för etisk användning av djur. 1. Beredning av utrustning Autoklav de kirurgiska verktygen före operation. Desinficera stereotaktisk apparat med 70% etanol. Slå på vattenbadet och hålla vattentemperaturen vid 42 ° C. Lös typ IV-S, Clostridium-kollagenas i normal saltlösning vid en koncentration av 0,…

Representative Results

På grund av skillnader i hematom (figur 1), är ipsilaterala svarvning visas omedelbart efter vakna för autolog blod injicerade möss och inom 2-4 timmar efter kollagenas injektion, som hematom expansionen sker (Figur 2). Avsaknad av ipsilaterala svarvning bör höja oro för avsaknaden av betydande skada. På det första inlägget skadedagen, bör möss i båda modellerna visar betydande neurologiska bortfall (Figur 3). Vid 24 h efter injektion, ipsilaterala hemisfä…

Discussion

Trots nya preklinisk forskning och resulterande stora kliniska prövningar för lovande terapi ^15-18, det finns inga farmakologiska interventioner visat att förbättra resultatet i ICH, och omsorg är i stort sett positiva. Listor med möjliga behandlingar kan genereras med hög genomströmning teknik, såsom transcriptomic och proteomik arbete. Även om dessa tekniker fortsätter att förbättra vår kunskap om potentiella terapeutiska mål, framåt och bakåt översättning av lovande mål kan bäst unders…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 µl Hamilton syringe	Hamilton Co.	86259	25 gauge needle
50 µl Hamilton syringe	Hamilton Co	7637-01
26G Hamilton needle	Hamilton Co	7804-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20-gauge, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE20	Becton-Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
30G 1 inch needle	Becton-Dickinson	305128
27G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD