Intrastriatal Injeksjon av Autolog blod eller clostridial Collage som murine modeller av intracerebral blødning

Summary

Preclinical models of intracerebral hemorrhage are utilized to mimic certain aspects of clinical disease. Thus, mechanisms of injury and potential therapeutic strategies may be explored. In this protocol, two models of intracerebral hemorrhage are described, intrastriatal (basal ganglia) injections of autologous blood or collagenase.

Abstract

Intracerebral blødning (ICH) er en vanlig form for cerebrovaskulær sykdom og er forbundet med betydelig sykelighet og dødelighet. Mangel på effektiv behandling og svikt i store kliniske studier som tar sikte på hemostase og blodpropp fjerning demonstrere behovet for ytterligere mekanisme-drevet etterforskning av ICH. Denne forskningen kan utføres gjennom de rammer som følger av prekliniske modeller. To murine modeller i populær bruk inkluderer intrastriatal (basalgangliene) injeksjon av enten autolog fullblod eller clostridial collagenase. Siden, representerer hver modell distinkt forskjellige patofysiologiske funksjoner som er relatert til ICH, kan bruken av en bestemt modell velges basert på hvilke side av sykdommen som skal studeres. For eksempel, autologt blod injeksjon representerer mest nøyaktig hjernens respons på nærværet av intraparenchymal blod, og kan nærmest replikere Lobar hemorrhage. Clostridial collage injeksjon representerer mest nøyaktig de small fartøy ruptur og hematom evolusjon karakteristisk for dype blødninger. Dermed hver modellresultater i ulike hematom dannelse, neuroinflammatory respons, cerebral ødem utvikling, og neurobehavioral utfall. Robusthet av en påstått terapeutisk intervensjon kan best vurderes ved hjelp av begge modellene. I denne protokollen, er induksjon av ICH med begge modellene, umiddelbare postoperative demonstrasjon av skader, og tidlig postoperativ behandling teknikker demonstrert. Begge modellene resultere i reproduserbare skader, hematom volumer, og neurobehavioral underskudd. På grunn av heterogeniteten av human ICH, er flere prekliniske modeller for å utforske grundig patofysiologiske mekanismer og teste potensielle terapeutiske strategier.

Introduction

Intracerebral blødning (ICH) er en relativt vanlig form for cerebrovaskulær sykdom med ca 40-50% av pasienter som er rammet dø innen 30 dager ^en. Dessverre har liten forbedring blitt gjort i dødelighet i løpet av de siste 20 år ^to. Rapporter fra National Institutes of Health ^tre og retningslinjer fra American Heart Association ^fire understreket betydningen av å utvikle klinisk relevante modeller av ICH å utvide forståelsen av patofysiologien og utvikle mål for nye terapeutiske tilnærminger.

Flere modeller finnes å etterligne menneskelig ICH ^fem. Som forståelse av ICH patofysiologi modnes, har det blitt klart at en rekke modeller kan anvendes for å undersøke forskjellige aspekter av sykdommen. Tidligere brukte modeller inkluderer murine amyloid angiopathy ^6, intraparenchymal microballoon innsetting og inflasjon ^7, og direkte arteriell blodinfiltrasjon ^8,9. Lobar blødning fra amyloid angiopati er blitt modellert med bruk av transgene mus og representerer en distinkt ICH subtype. Microballoon modeller etterligne akutt masseeffekt fra hematomdannelse men mislykkes i å fange hjernens cellulær respons på nærværet av blod. Endelig fag direkte arteriell blod infiltrasjon hjernen til arterielle press fra lårarterie. Dermed gjør denne modellen ligner arterielle press og tilstedeværelse av blod, men ikke utsett hjernen til mikrovaskulær skade fra små blodkar sprekker. Videre har denne modellen iboende høy variabilitet. Interessant, spontant hypertensive rotter ¹⁰ utvikle spontan ICH som de gamle. Studier av disse dyrene etter at ICH utvikling kan ligne sykdommen i nærvær av en av de store comorbidities predisponerende mennesker til ICH. Selv om disse andre modeller finnes, intrastriatal injeksjon av clostridial kollagenase ¹¹ eller instrastiatal injeksjon av enutologous fullblod ¹² er, for tiden, de to vanligste modellene som brukes i preklinisk ICH forskning.

ICH modellvalg bør gjøres basert på formålet med eksperimentelle spørsmål, herunder arter utvalg og metode for å indusere dannelse av hematomer. For eksempel, griser er store dyr med relativt store hvite substansen hjernevolum sammenlignet med mus. Således blir svin-modeller egnet for å studere hvit substans patofysiologien følgende ICH. I kontrast, gnager hjerner er stort sett grå materie, men transgene systemer gjør gnagere nyttig å vurdere molekylære mekanismer for skader og restitusjon etter ICH. Hver modell har sin iboende styrker og svakheter (Tabell 1), noe som bør vurderes nøye før eksperimentering.

De følgende protokoller demonstrere autologt blod og kollagenase injeksjon modeller i mus. Disse modellene har hver blitt oversatt fra modeller som opprinnelig ble utviklet i rotter^13,14 og tillate bruk av allment tilgjengelig transgen teknologi for å utforske molekylære mekanismer knyttet til celledød etter ICH. Begge representerer svært ulike skademekanismer fra menneskelig ICH, og begge har tydelig forskjellig forventet resultat i form av atferdsmessige og histologiske tiltak. Dermed kan enkelte hypoteser egner seg til en modell over den andre, men mange ideer kan kreve validering i begge modellene.

Tabell 1. Sammenligning av egenskapene til collagenase-og autologe blod injeksjon intracerebral blødning modeller.

<tr>

	Kollagenase Injection	Blood Injection
Enkel bruk	+ + +	+ +
Reproduserbarhet	+ +	+ +
Kontroll av Blødning Size	+ +	+ + +
Blood Reflux	+	+ +
Simulerer menneskelig sykdom	+	–
Enkelhet	+ +	+ +
Bruk hos flere arter	+ +	+ +

Protocol

Etikk Uttalelse: Denne protokollen er godkjent av Duke University Institutional Animal Care og bruk komité og følger alle retningslinjer for etisk bruk av dyr. En. Utarbeidelse av utstyr Autoklav de kirurgiske verktøy før operasjonen. Desinfiser stereotactic apparat med 70% etanol. Slå på vannbad og holde temperaturen ved 42 ° C. Oppløs-type IV-S clostridial kollagenase i normal saltoppløsning ved en konsentrasjon på 0.075 U per 0,4 mL. </li…

Representative Results

På grunn av forskjeller i hematomdannelse (figur 1), blir ipsilaterale vende vist umiddelbart etter våkne for autolog blod injiserte mus og i løpet av 2 – 4 timer etter injeksjon kollagenase, som hematom ekspansjon forekommer (figur 2). Fravær av ipsilaterale vende bør heve bekymring for fravær av betydelig skade. På det første innlegget skade dagen, bør mus i begge modellene viser signifikante nevrologiske underskudd (figur 3). På 24 timer etter injeksjonen, …

Discussion

Til tross for fremvoksende preklinisk forskning og resulterende store kliniske studier for lovende legemiddel ^15-18, er det ingen farmakologiske intervensjoner vist seg å forbedre resultatet i ICH og omsorg fortsatt i stor grad støttende. Lister over mulige behandlingsformer kan være generert av høy gjennomstrømning teknologier, for eksempel transcriptomic og proteomikk arbeid. Mens disse teknologiene fortsetter å fremme vår kunnskap om potensielle terapeutiske mål, fremover og bakover oversettelse av…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic frame	Stoelting Co.	51603
Probe holder with corner clamp	Stoelting Co.	51631
Mini grinder	Power Glide	Model 60100002
0.5 µl Hamilton syringe	Hamilton Co.	86259	25 gauge needle
50 µl Hamilton syringe	Hamilton Co	7637-01
26G Hamilton needle	Hamilton Co	7804-03
Syringe pump	KD Scientific	Model 100
Heat therapy water pump	Gaymar Industries, Inc.	Model# TP650
Circulating waterbed	CMS Tool & Die, Inc.
Rodent ventilator	Harvard Apparatus	Model 683
Isoflurane vaporizer	Drager	Vapor 19.1
Air flowmeter	Cole Parmer	Model PMR1-010295
Induction chamber			Self made
Otoscope	Welch Allyn	22820
intravenous catheter	Becton-Dickinson	381534	20-gauge, 1.16 inch Insyte-W
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	NDC10019-360-69
Collagenase Type IV-S	Sigma	C1889
Polyethylene tubing PE20	Becton-Dickinson	427406
Polyethylene tubing PE10	Becton-Dickinson	427401
30G 1 inch needle	Becton-Dickinson	305128
27G 1 1/4 inch needle	Becton-Dickinson	305136
Surgical scissors	Miltex	21-539
Forceps	Miltex	17-307
Needle holder	Boboz	RS-7840
Monofilament suture	Ethicon	8698	Size 5-0
Indicating controller	YSI	73ATD