Fabrication de concentré, de l'oxygène à base de lipides microbulles émulsions par cisaillement élevé homogénéisation et la concentration de série
Summary
Nous décrivons des procédés pour la fabrication de grandes quantités de micro-bulles d'oxygène à base de lipides (OLM) conçus pour la délivrance par voie intraveineuse de l'oxygène en utilisant une homogénéisation à cisaillement élevé et la concentration en série.
Abstract
microbulles remplies de gaz ont été mis au point en tant que contraste ultrasonore et des agents de libération de médicaments. Les microbulles peuvent être produits par traitement à l'aide des tensioactifs sonication, une agitation mécanique, des dispositifs microfluidiques, ou l'homogénéisation. Récemment, des microbulles d'oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour fournir de l'oxygène par voie intraveineuse en cas d'urgence médicale, inversant hypoxémie de la vie en danger, et de prévenir tout dommage ultérieur d'organes, l'arrêt cardiaque et la mort. Nous présentons les méthodes pour la production à l'échelle-up de microbulles hautement oxygénées à l'aide d'une boucle fermée à cisaillement élevé d'homogénéisation. Le processus peut produire 2 L de LOM concentrées (90% en volume) en 90 min. Les bulles résultantes ont un diamètre moyen d'environ 2 pm, et un profil rhéologique conforme à celle du sang lorsqu'il est dilué à 60% en volume. Cette technique produit OLM à haute capacité et à haute pureté de l'oxygène, ce qui suggère que cette technique peut être utile pour les laboratoires de recherche translationnelle.
Introduction
Microbulles composés de protéines, de polymère, et des obus de lipides ont été développés en tant que vecteurs pour l'administration de médicaments, la thérapie génique et les agents de contraste ultrasonores 1-5. Parce que ces utilisations thérapeutiques nécessitent persistance microbulles intravasculaire, ces microbulles sont généralement remplis de gaz moléculaire, de poids élevés inertes tels que les hydrocarbures perfluorés 6, qui ont une faible solubilité dans le sang et stabilisent le 3,4 bulle.
Récemment, des microbulles d'oxygène à base de lipides (OLM) ont été conçus pour administrer des doses thérapeutiques de l'oxygène, ce qui peut préserver l'apport d'oxygène aux organes cibles et prévenir l'instabilité hémodynamique pendant les périodes d'obstruction des voies respiratoires ou hypoxémie 7. Émulsions conçus pour la livraison de gaz par voie intraveineuse ont besoin de différents éléments de conception que ceux utilisés pour les agents de contraste ultrasonores ou administration ciblée des médicaments. En premier lieu, parce que le corps consomme de grandes quantités de gaz d'oxygène (~ 200 ml / min), OLM doivent être produites etinjecté sur une grande échelle. Il faut pour cela que le procédé de fabrication soit efficace. Deuxièmement, le processus de fabrication doit être en boucle fermée afin d'éviter la contamination de l'azote à travers l'exposition de LOM (qui doit être rempli avec 100% d'oxygène) à l'air ambiant. Troisièmement, parce que le but de LOM est la livraison de gaz par voie intraveineuse, la fraction de gaz de LOM doit être maximisée, en reconnaissant les limites imposées par la viscosité de l'émulsion 7. Enfin, comme avec n'importe quel injectable par voie intraveineuse, un contrôle précis de la distribution de taille des particules est indispensable pour éviter l'obstruction microvasculaire 8.
Il existe plusieurs méthodes établies pour la fabrication de micro-bulles. La sonication utilise une grande intensité, à basse fréquence ultrasonore appliquée à l'interface air-liquide d'une émulsion qui comprend un agent tensio-actif, tel qu'un phospholipide amphipathique, en présence d'un ciel gazeux pour produire des microbulles 7,9. Ce processus peut être commandé en faisant varier ultrala fréquence du son, la puissance et la durée d'impulsion, et la distribution de la taille résultante peuvent être adaptées pour produire des micro-bulles d'une distribution de taille spécifique, bien que la sonication est rarement utilisé dans la fabrication de micro-bulles cliniquement utilisés. Fusion est l'agitation mécanique intense d'un tensioactif et de gaz dans un système fermé, qui est également difficile à l'échelle en place pour accueillir de grands volumes 2. Microfluidique à base de gouttelettes permet un contrôle précis de la distribution de taille des microbulles de 10 à 13. Bien que traditionnellement difficile d'extrapoler, multi-canal, la microfluidique à haut débit ont été décrits qui augmentent l'efficacité de la production de microbulles 13. Microbulles fabriqués en utilisant une de ces méthodes peuvent nécessiter des processus de réduction de la taille de post-production, telles que le fractionnement centrifuge 14,15 et 16,17 microbulles flottation.
Une autre méthode connue pour la fabrication de micro-bulles très stables au cisaillement est homogenization 6, ce qui peut se traduire par un motif hexagonal de phospholipide stabilisateur sur la surface à microbulles 18. S'appuyant sur ce concept, nous décrivons l'incorporation d'un cisaillement élevé homogénéisateur en ligne pour créer OLM d'auto-assemblage 19. Dans ce processus, l'homogénéisation utilise des lames en rotation rapide à proximité de deux beaux écrans maille émulseur, créant un fort cisaillement mécanique et hydraulique pour la création de micro-bulles. Concentration de série de l'émulsion lipidique à travers ce système produit une fraction de gaz de plus en plus concentrées, qui peuvent être encore plus concentré par centrifugation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus importantes à la création concentrés OLM, très oxygénés comprennent: 1) veiller à ce que l'espace libre dans le HCT reste entièrement oxygéné; 2) veiller à ce que la pureté des excipients lipidiques est optimal (y compris les conditions de stockage et d'utilisation des produits BPF); 3) faire en sorte que les lipides en poudre se mélangent complètement avec la phase aqueuse avant l'amorçage du système; et 4) portant une attention particulière à l'augmentation de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financement: US Army Research & Medical Materiel Command (USAMRMC) et géré par la télémédecine et avancée Technology Research Center. Shunxi Ji a contribué à la modification des seringues comme décrit ici.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick – 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt – 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 mL syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
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