섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
신경 조직 공학의 지속적인 과제 중 하나는 신경이 자연적으로 성장 세포 외 매트릭스를 모방 한 신경 도관 (NC)를 만드는 것입니다. 연구는 세포가 기계, 지형, 접착제 및 화학 신호 1-3 포함한 환경에서 여러 가지 요인에 반응 것으로 나타났습니다. 이 분야의 주된 문제점 중 하나는 신호들의 적절한 조합을 결정하고 세포의 성장을 지원하기 위해 4 장기간 큐들을 유지할 수있는 시스템을 제조한다. 말초 신경은 연질 기판을 선호하는 것으로 알려져있다, 섬유 배향에 의해 지시되는, 신경 성장 인자 (NGF)에 대응 5-7. 주 화학적 신호를 제공 할 수있는 나노 결정은 가까운 이식, 신경 수리 8,9 현재 금 표준의 기능 회복에 대한 개선을 제공하는 것으로 나타났다.
재료 및 제조 방법은 각종 기계적 및 지형 생성하는데 사용될 수있다알은 10-13 큐들. 기계 단서 1,13 중요한 애플리케이션에 대한 적절한 재료의 선택을, 선택된 물질에 고유하다. 생산 방법은 지형적 단서가 상분리, 자기 조립 및 1,13 전기 방사를 포함 제어한다. 마이크로 애플리케이션, 마이크로 유체, 포토 패터닝, 에칭, 염 침출 또는 가스 발포체를 들어도 14-17을 사용할 수있다. 전기 방사로 인해 유연성 및 생산 13,18-23의 용이성에 조직 배양을위한 섬유 기판을 설계하는 가장 인기있는 방법으로 떠오르고있다. 전기 방사 나노 섬유는 그 자체 격퇴 24를 방전 짧은 갭을 가로 질러 스트레칭 일으키는 고분자 용액에 고전압을인가함으로써 제조된다. 정렬 비계 접지 회전 맨드릴에 섬유를 수집하여 생성 할 수 있습니다 및 비동맹 비계는 고정 플레이트 (25)에 수집됩니다. 접착 시그널링은 섬유질 골격 재치 코팅함으로써 달성 될 수있다H의 피브로넥틴 또는 26을 전기 방사 전에 HA 그러한 RGD 같은 접착 펩타이드, 컨쥬 게이트.
그들이 제어 방출을위한 소스가 필요하기 때문에 이러한 성장 인자와 같은 화학 신호는, 장기간에 걸쳐 유지하는 것이 가장 어렵다. 대부분의 시스템은 성공의 다양한 수준으로 전기 방사 섬유 네트워크 제어 방출을 추가하려고 시도하고있다. 이러한 방법은 혼합 전기 방사, 에멀젼 전기 방사, 코어 쉘 전기 방사 및 단백질 접합 (27)을 포함한다. 또한, 전기 방사는 전통적 따라서 단백질의 생활 성이 고려되어야 유지, 단백질 (28)의 생존에 영향을 미칠 수 휘발성 용매에서 수행된다.
이 접근법은 특히 말초 신경 성장 동조 지지체를 작성하기 위해 기계적, 지형, 화학적 및 접착 신호를 결합 다룬다. 비계 역학 정밀 합성에 의해 제어된다methacrylated 히알루 론산 (HA). 메타 크릴 사이트는 사진 반응 가교제를 연결하는 데 사용됩니다. 가교 물질은 더 이상 수용성없는 독점적 효소 (29)에 의해 분류됩니다. 가교제의 양이 열화 속도, 기계 및 기타 물질의 물성을 변화시킨다. ~ 500 Pa의 인장 탄성률이 30 % 메타 크릴로 HA를 사용하여 신경 조직의 기본 역학에 가까운 일반적으로 신경 세포 26,29 선호하는 부드러운 기판을 만듭니다. 회전하는 맨드릴에 전기 방사하는 지형 큐에 대한 정렬 된 섬유를 만드는 데 사용됩니다. 미소와 함께 전기 방사를 사용하면 확장 된 기간 동안 비계 내에서 화학적 신호를 제공한다. 화학적 신호를 생성하는 데 사용되는 NGF를 함유하는 미세 신경 돌기 성장을 지원하기 위해. NGF 생산시 솔벤트가 발생하지 않도록 대부분의 전기 방사 물질과는 달리 HA는 물에 용해합니다. , SCA를 접착제 신호를 추가하려면ffold는 피브로넥틴으로 코팅된다. NGF는 피브로넥틴 (접착제)로 코팅 된 마이크로 스피어 (화학)를 해제 소프트 (기계) 정렬 (지형) 섬유 : 완성 된 시스템은 전술 한 신호의 네 종류가 포함되어 있습니다. 생산 및이 시스템의 테스트는이 프로토콜에 설명되어있다.
프로세스는 유중 수중 이중 에멀젼 미립자의 제조로 시작된다. 에멀젼은 계면 활성제, 폴리 비닐 알코올 (PVA)로 안정화된다. 내부 수상은 단백질이 포함되어 있습니다. 이를 디클로로 메탄 (DCM)에 용해 PLGA 쉘 물질을 함유하는 유상에 첨가 될 때, 계면 활성제는 DCM로부터 단백질을 보호 상 사이의 장벽을 생성한다. 이 미소 에멀젼의 외부 표면을 생성하기 위해 PVA를 함유하는 다른 수상에 분산보다. 안정한 에멀젼을 DCM가 증발 할 수 있도록 교반 하였다. 세정 및 동결 건조 후에는 건조 미소의 계속 남아 있습니다단백질 aining.
미소가 완료되면 그들은 발판으로 전기 방사 할 준비가 된 것입니다. 먼저 전기 방사 용액을 제조. 용액의 점도는 적절한 섬유 형성에 중요하다. 순수 HA의 솔루션은 이러한 요구 사항을 충족하지 않는; PEO는 전기 방사를 허용하는 담체 중합체로 추가된다. 마이크로 전반에 걸쳐 분산 미소와 섬유 지지체의 결과로 솔루션 및 전기 방사에 추가됩니다.
제작이 완료되면, 단백질은 그 가능성을 검증하기 위해 테스트되어야한다. 이를 위해, NGF에 응답 일차 전지가 사용될 수있다. 이 프로토콜은 8 ~ 10 일 이전 닭 배아에서 등쪽 뿌리 신경절 (DRG)를 사용합니다. 셀 번들은 NGF 또는 비어있는 것들로 가득 미소를 포함하는 발판에 씨앗을 품고있다. NGF는 여전히 실행 가능한 경우에는 NGF 포함 비계에 강화 된 신경 돌기의 성장을 볼 수 있습니다. NGF가 더 이상 실행 가능한 없으면 그것 것하지 확장하는 신경 돌기를 촉진하고 컨트롤과 유사하게 나타납니다.
본원에 설명 된 정확한 순서는 단순한 변형 재료, 전기 방사 방법 및 시스템은 다양한 세포 및 조직 종류에 최적화 될 수있는 단백질로, 그러나, 신경 지지체 상에 집중된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 연구는 신경 세포가 지형적 큐들 (섬유 배향) 및 화학 신호 (성장 인자) 1,2,10,11,35로 지향 될 수 있음을 보여 주었다. 전기 방사는 정렬 된 섬유를 만들 수있는 손쉬운 방법이다. 성장 인자는 신경 성장하지만 신경 도관 (NC)로 포함하기 위해, 지속 방출을위한 방법이 요구된다 바랍니다. 두 신호와 함께보다 강력한 시스템을 만들려면 다음이 신호가 결합되어야한다. 여러 가지 방법으로…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
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