عامل نمو Electrospinning الافراج الجزئي في الليفية السقالات
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
أحد التحديات المستمرة في هندسة الأنسجة العصبية هو خلق قناة العصبية (NC) الذي يحاكي مصفوفة الخلوية الإضافية، حيث تنمو الأعصاب بشكل طبيعي. وقد أظهرت الأبحاث أن الخلايا تستجيب إلى عدة عوامل في بيئتها بما في ذلك الميكانيكية، والطبوغرافية، لاصق وإشارات كيميائية 1-3. أحد التحديات الرئيسية في هذا المجال وتحديد توليفة مناسبة من الإشارات وافتعال النظام الذي يمكن الحفاظ العظة لفترة طويلة لدعم نمو الخلايا 4. ومن المعروف أن الخلايا العصبية الطرفية يفضلون ركيزة لينة، يتم إخراج الألياف الانحياز، واستجابة لعامل نمو الأعصاب (NGF) 5-7. وقد ثبت أن البلاغات التي يمكن أن توفر الاشارات الكيميائية لأسابيع لتوفير وتحسين الانتعاش وظيفية أقرب إلى أن من المغايرة، المعيار الذهبي الحالي للإصلاح العصبية 8،9.
المواد وطرق الإنتاج المختلفة يمكن استخدامها لإنتاج الميكانيكية والطبوغرافيةآل العظة 10-13. العظة الميكانيكية هي الملازمة لاختيار المواد، مما يجعل اختيار المواد المناسبة لتطبيق الحرج 1،13. أساليب الإنتاج للسيطرة وتشمل العظة الطبوغرافية مرحلة الانفصال، التجميع الذاتي وelectrospinning 1،13. لتطبيقات الميكروسكيل، على microfluidics، photopatterning، الحفر، الترشيح الملح، أو الرغاوي الغاز يمكن أن تستخدم أيضا 14-17. وقد برز Electrospinning باعتبارها السبيل الأكثر شعبية لهندسة ركائز لزراعة الأنسجة الليفية بسبب مرونته وسهولة إنتاج 13،18-23. هي ملفقة ألياف النانو Electrospun عن طريق تطبيق الجهد العالي إلى حل البوليمر الامر الذي ادى الى صد نفسها وتمتد عبر فجوة قصيرة لأداء 24. يمكن إنشاء سقالة الانحياز عن طريق جمع الألياف على مغزل بالتناوب على الارض ويتم جمع السقالات عدم الانحياز على لوحة ثابتة 25. ويمكن تحقيق التصاق الإشارات بواسطة طلاء سقالة الطرافة ليفيةح فبرونيكتين أو التصريف على التصاق الببتيد، مثل RGD، إلى HA قبل electrospinning 26.
الإشارات الكيميائية، مثل عوامل النمو، هي الأكثر صعوبة في الحفاظ على مدى فترات طويلة لأنهم بحاجة إلى مصدر للافراج رقابة. وقد حاول العديد من أنظمة لإضافة الافراج تسيطر على شبكات ليفية electrospun مع مستويات متفاوتة من النجاح. وتشمل هذه الأساليب electrospinning مزيج، مستحلب electrospinning، قذيفة الأساسية electrospinning والبروتين اقتران 27. بالإضافة إلى ذلك، يتم electrospinning تقليديا في مذيب متطاير، والتي يمكن أن تؤثر على صلاحية البروتين 28، لذلك يجب النظر في الحفاظ على النشاط الحيوي للبروتين.
ويتناول هذا النهج تحديدا الجمع، الطبوغرافية، وإشارات لاصقة الكيميائية والميكانيكية لإنشاء سقالة الانضباطي للنمو الأعصاب الطرفية. يتم التحكم الميكانيكا سقالة بدقة عن طريق تجميعحمض هيالورونيك methacrylated (HA). وتستخدم المواقع methacrylation إرفاق صورة crosslinkers رد الفعل. المواد crosslinked لم يعد للذوبان في الماء، ويتم تقسيم حصرا بنسبة 29 الانزيمات. كمية يشابك يتغير معدل التحلل، والميكانيكا وغيرها من الخصائص الفيزيائية للمادة. باستخدام HA مع 30٪ methacrylation، التي لديها معامل الشد من ~ 500 باسكال، ويخلق ركيزة الناعمة التي هي قريبة من الميكانيكا الأم من الأنسجة العصبية ويفضل عادة من قبل الخلايا العصبية 26،29. Electrospinning على مغزل بالتناوب يتم استخدامها لإنشاء ألياف الانحياز لجديلة الطبوغرافية. باستخدام electrospinning مع المجهرية يوفر إشارات الكيميائية داخل السقالة على مدى فترات طويلة. لدعم النمو محوار المجهرية تحتوي على NGF يتم استخدامها لإنشاء إشارة كيميائية. وخلافا لمعظم المواد electrospun HA قابل للذوبان في الماء لذلك NGF لا تواجه المذيبات قاسية أثناء الإنتاج. لإضافة إشارة لاصقة، وهيئة السلع التموينيةوهي مغلفة مع فبرونيكتين ffold. يحتوي على نظام الانتهاء من جميع الأنواع الأربعة من الإشارات المذكورة أعلاه: لينة (الميكانيكية) محاذاة (الطبوغرافية) الألياف مع NGF الإفراج المجهرية (الكيميائية) المغلفة مع فبرونيكتين (لاصق). يوصف إنتاج واختبار هذا النظام في هذا البروتوكول.
العملية تبدأ إنتاج المجهرية مع مزدوجة مستحلب المياه في والنفط في المياه. واستقرت مستحلب مع السطحي، كحول البولي فينيل (PVA). المرحلة المياه الداخلية تحتوي على البروتين. كما يتم إضافته إلى مرحلة النفط، التي تحتوي على المواد قذيفة PLGA حله في ثاني كلورو ميثان (DCM)، والسطحي يخلق حاجزا بين المراحل حماية البروتين من DCM. هذا هو مستحلب من المياه فرقت في مرحلة أخرى تحتوي على PVA لإنشاء السطح الخارجي للالمجهرية. يحرك مستحلب مستقر للسماح للDCM لتتبخر. بعد الشطف وlyophilizing كنت مع ترك المجهرية تابع الجافaining البروتين.
بعد الانتهاء من المجهرية التي تكون جاهزة للelectrospun في السقالات. أولا أنت تعد الحل electrospinning. اللزوجة من حل أمر حاسم لتشكيل الألياف المناسب. حلول النقي HA لا تلبي هذا المطلب. يضاف PEO كما البوليمر الناقل للسماح electrospinning. تضاف المجهرية في حل وelectrospun مما أدى إلى سقالة ليفية مع المجهرية وزعت في جميع أنحاء.
مرة واحدة إنتاج كاملة، ينبغي اختبار البروتين للتحقق من قدرتها على البقاء. للقيام بذلك، والخلية الأولية التي تستجيب لNGF يمكن استخدامها. يستخدم هذا البروتوكول الجذر الظهرية العقد (DRG) من أجنة الدجاج يوم 8-10 القديمة. هي المصنفة حزم الخلايا على السقالات التي تحتوي على المجهرية مليئة NGF أو تلك التي هي فارغة. إذا كان NGF لا يزال قابلا للتطبيق سترى تعزيز النمو محوار على السقالات التي تحتوي على NGF. إذا كان NGF لم يعد قابلا للتطبيق وسوفلا تعزيز neurites التي لتوسيع ويجب أن تظهر مشابهة لعنصر التحكم.
ويتركز الإجراء المحدد الموصوفة هنا على دعم العصبي، ومع ذلك، مع تعديلات بسيطة على المواد، طريقة electrospinning، وبروتينات نظام يمكن أن يكون الأمثل لمختلف أنواع الخلايا والأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا العصبية يمكن إخراج العظة الطبوغرافية (محاذاة الألياف) والاشارات الكيميائية (عوامل النمو) 1،2،10،11،35. Electrospinning هو أسلوب سطحي لخلق ألياف الانحياز. عوامل النمو تشجع نمو الأعصاب ولكن من أجل إدراجها في قنوات العصب (NC)، مطلوب طري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O’Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. . The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition – 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -. I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O’Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. . Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -. Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
