Electrospinning Growth Factor Releasing Mikrosfærer i Fiber Stilladser
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
En af de aktuelle udfordringer i nervevæv teknik skaber en nerve ledning (NC), der efterligner den ekstra cellulære matrix, hvor nerverne vokser naturligt. Forskning har vist, at celler reagerer på flere faktorer i deres miljø, herunder mekaniske, topografiske, lim og kemiske signaler 1-3. En af de primære udfordringer på dette område er at fastlægge den rette kombination af signaler og opdigte et system, der kan opretholde stikord i en længere periode til at understøtte cellevækst 4. Perifere neuroner er kendt for at foretrække et blødt underlag, ledes af linie fibre og svare nervevækstfaktor (NGF) 5-7. NCs der kan give kemiske signaler i ugevis er blevet vist at tilvejebringe forbedret funktionel restitution tættere på allotransplantater, den nuværende guldstandarden til nervereparation 8,9.
Forskellige materialer og fremstillingsmetoder kan anvendes til at frembringe mekanisk og topografiskal køer 10-13. Mekaniske signaler er uløseligt forbundet med det valgte materiale, hvilket gør valget af den passende materiale for anvendelse kritiske 1,13. Produktionsmetoder til at styre topografiske tidskoder omfatter fase separation, selv-samling og electrospinning 1,13. Til mikroskala applikationer, mikrofluidik, photopatterning, ætsning, salt udvasker eller gas skum kan også anvendes 14-17. Electrospinning har vist sig som den mest populære måde at konstruere fiberholdige substrater for vævskultur grund af sin fleksibilitet og brugervenlighed produktion 13,18-23. Electrospun nanofibre er fremstillet ved anvendelse af en høj spænding til en polymer løsning får det til at frastøde sig og strække sig over en kort afstand til aflade 24. En afstemt stillads kan skabes ved at samle fibrene på en jordet roterende dorn og Alliancefri stilladser indsamles på en stationær plade 25. Adhæsion signalering kan opnås ved at overtrække den fibrøse stillads Vidh fibronectin eller konjugering vedhæftning peptid, såsom RGD, at HA før Electrospinning 26.
Kemiske signaler, såsom vækstfaktorer, er de mest vanskeligt at opretholde i længere tid, fordi de har brug for en kilde til kontrolleret frigivelse. Mange systemer er blevet forsøgt at tilføje kontrolleret frigivelse til electrospun fibrøse netværk med varierende grad af succes. Disse metoder omfatter blanding elektrospinning, emulsion elektrospinning, kerne-kappe elektrospinning og protein konjugering 27. Derudover er elektrospinning traditionelt udført i et flygtigt opløsningsmiddel, som kan påvirke levedygtigheden af proteinet 28 fastholder derfor bioaktiviteten af proteinet skal overvejes.
Denne tilgang specifikt kombinerer mekaniske, topografiske, kemiske og selvklæbende signaler for at skabe en indstillelig stillads til perifer nerve vækst. Scaffold mekanik styres præcist ved at syntetiseremethacryleret Hyaluronsyre (HA). De methacrylation websteder bruges til at vedhæfte foto reaktive tværbindere. Det tværbundne materiale ikke længere er vandopløselig og er udelukkende fordelt enzymer 29. Mængden af tværbinding ændrer nedbrydningshastigheden, mekanikere og andre fysiske egenskaber af materialet. Brug af HA med 30% methacrylation, som har et elasticitetsmodul på ~ 500 Pa, skaber en blød underlag, som er tæt på de indfødte mekanik nervevæv og er typisk foretrækkes af neuroner 26,29. Electrospinning på en roterende dorn benyttes til at skabe aligned fibre til et topografisk stikord. Brug electrospinning sammen med mikrokugler giver kemiske signaler inden stilladset over længere perioder. For at understøtte neurit vækst mikrosfærer indeholdende NGF anvendes til at skabe det kemiske signal. I modsætning til de fleste electrospun materialer HA er opløseligt i vand, således at NGF ikke støder stærke opløsningsmidler under produktionen. For at tilføje en klæbende signal, SCAffold er belagt med fibronectin. Den færdige Systemet indeholder alle fire typer signaler, der er beskrevet ovenfor: blød (mekanisk) vender (topografiske) fibre med NGF frigiver mikrosfærer (kemisk), belagt med fibronectin (lim). Produktion og afprøvning af dette system er beskrevet i denne protokol.
Processen begynder med fremstilling af mikrosfærer med en vand-i-olie-i-vand Double emulsion. Emulsionen er stabiliseret med et overfladeaktivt middel, polyvinylalkohol (PVA). Den indvendige vandfase indeholder proteinet. Som det er tilsat til oliefasen, der indeholder PLGA skalmateriale opløst i dichlormethan (DCM), det overfladeaktive middel danner en barriere mellem faserne beskytter proteinet fra DCM. Denne emulsion er end dispergeret i en anden vandfase indeholdende PVA for at skabe den ydre overflade af mikrokuglerne. Den stabile emulsion omrøres for at tillade DCM'en at fordampe. Efter skylning og lyofilisere du står tilbage med den tørre mikrosfærer fortsaining proteinet.
Efter mikrokuglerne er afsluttet de er klar til at blive electrospun i stillads. Først skal du forberede elektrospinningsprocessen løsning. Viskositeten af opløsningen er kritisk for korrekt fiberdannelse. Opløsninger af ren HA ikke opfylder dette krav; PEO tilsættes som en bærerpolymer for at tillade elektrospinning. Mikrokuglerne tilsættes til opløsningen, og electrospun resulterer i en fibrøs stillads med mikrosfærer fordelt overalt.
Når produktionen er færdig, skal proteinet testes for at kontrollere dens levedygtighed. For at gøre dette, kan en primær celle, der reagerer på NGF anvendes. Denne protokol bruger dorsalrodsganglier (DRG) 8-10 dage gamle kyllingeembryoner. Cellen bundter podes på stilladser indeholdende mikrosfærer fyldt med NGF eller dem, der er tomme. Hvis NGF er stadig levedygtige, bør du se forbedrede neurite vækst på NGF indeholder stilladser. Hvis NGF ikke længere er levedygtig det vilikke fremmer neuriter at udvide og bør ligne kontrollen.
Den nøjagtige procedure, der er beskrevet heri, er fokuseret på neurale støtte, dog med enkle modifikationer af materiale, elektrospinningsteknik metode og proteiner systemet kan optimeres til forskellige celle-og vævstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mange undersøgelser har vist, at nervecellerne kan rettes ved topografiske signaler (fiber justering) og kemiske signaler (vækstfaktorer) 1,2,10,11,35. Electrospinning er en let metode til at skabe aligned fibre. Vækstfaktorer fremme nerve vækst, men for at medtage dem i nerve kanaler (NC), er en metode til vedvarende frigivelse kræves. At skabe et mere robust system med både køer, bør disse to signaler kombineres. Flere metoder er tidligere blevet undersøgt for at give forlænget frigivelse af prote…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O’Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. . The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition – 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -. I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O’Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. . Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -. Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
