Electro Growth Factor Releasing Microspheres inn i fibre Stillas

Summary

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Abstract

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

Introduction

En av de pågående utfordringer i nervevev teknikk er å skape en nerveledning (NC) som etterligner de ekstra cellulær matrise, hvor nerver vokse naturlig. Forskning har vist at cellene svare på flere faktorer i deres miljø, inkludert mekanisk, topografiske, lim og kjemiske signaler ^1-3. En av hovedutfordringene i dette felt er å bestemme den passende kombinasjon av signaler, og fremstilling av et system som kan opprettholde signaler i en lengre periode for å støtte cellevekst ^4. Perifere nerveceller er kjent for å foretrekker et mykt underlag, bli dirigert av innrettede fibre og svare på nervevekstfaktor (NGF) ^5-7. Norsk kontinentalsokkel som kan gi kjemiske signaler i flere uker har vist seg å gi bedre funksjonell bedring tettere til det av allografter, gjeldende gullstandarden for nervereparasjon ^8,9.

Forskjellige materialer og produksjonsmetoder kan anvendes for å produsere mekanisk og topografiskal Køer ^10-13. Mekaniske signaler er iboende i materialet valgt, noe som gjør valg av passende materiale for anvendelse kritisk ^1,13. Produksjonsmetoder for å kontrollere topografiske signaler inkluderer faseseparasjon, selv-montering og electro ^1,13. For mikroprogrammer, MicroFluidics, photopatterning, etsing, salt igler, eller gass-skum kan også brukes ^14-17. Electro har dukket opp som den mest populære måten å konstruere fibrøse underlag for vev kultur på grunn av sin fleksibilitet og enkel produksjon ^13,18-23. Elektrospunnede nanofiltre er fremstilt ved å påføre en høy spenning til en polymeroppløsning slik at det å slå tilbake i seg selv, og strekker seg over en kort gap til å slippe ut ^24. En justert stillaset kan skapes ved å samle fibrene på et jordet dreiende spindel og alliansefrie stillaser er samlet på en stillestående plate ^25. Adhesjon signale kan oppnås ved å belegge den fibrøse stillaset with fibronektin eller conjugating en vedheft-peptid, slik som RGD, til HA før electro ^26.

Kjemiske signaler, slik som vekstfaktorer, som er mest vanskelig å opprettholde over lengre perioder, fordi de trenger en kilde for kontrollert frigjøring. Mange systemer har blitt forsøkt å legge kontrollert utslipp til elektrospunnede fibernett med varierende grad av suksess. Disse metodene inkluderer blanding electrospinning, emulsjon electrospinning, core shell electrospinning og protein conjugation ^27. I tillegg er elektrospinning tradisjonelt gjort i et flyktig oppløsningsmiddel, som kan påvirke levedyktigheten av proteinet ^28, således opprettholde bioaktivitet av proteinet må tas i betraktning.

Denne tilnærmingen spesifikt omhandler kombinere mekanisk, topografiske, kjemiske og lim signaler for å skape en fleksibel stillas for perifer nerve vekst. Stillas mekanikk styres nøyaktig ved å syntetiseremethacrylated Hyaluronsyre (HA). De methacrylation nettsteder blir brukt til å feste foto reaktive crosslinkers. Den fornettede materialet ikke lenger er vannløselige og er utelukkende fordelt av enzymer ^29. Mengden av tverrbindings endrer nedbrytningshastigheten, mekanikere og andre fysiske egenskaper av materialet. Ved hjelp av HA med 30% methacrylation, som har en strekkmodul ~ 500 Pa, skaper et mykt underlag som er nær de innfødte mekanikken i nervevev og er vanligvis foretrukket av nevroner ^26,29. Elektrospinning på en roterende dor brukes til å skape innrettede fibre for en topografisk signalet. Ved hjelp av electro sammen med mikrosfærer gir kjemiske signaler i stillaset over lengre perioder. For å støtte neurite vekst-mikrokuler inneholdende NGF blir brukt til å skape det kjemiske signal. I motsetning til de fleste materialer elektrospunnede HA er oppløselig i vann slik at NGF ikke støter sterke løsningsmidler under fremstillingen. For å legge til en selvklebende signal, SCAffold er belagt med fibronectin. Det ferdige systemet inneholder alle fire typer signaler som er beskrevet ovenfor: myke (mekanisk) justert (topografiske) fibrer med NGF slippe sfærer (kjemisk) belagt med fibronectin (lim). Produksjon og testing av dette systemet er beskrevet i denne protokollen.

Prosessen begynner med fremstillingen av mikrokuler med en vann-i-olje-i-vann-emulsjon dobbel. Emulsjonen er stabilisert med et overflateaktivt middel, polyvinylalkohol (PVA). Den indre vannfasen inneholder proteinet. Som det tilsettes til oljefasen, inneholdende PLGA skallmaterialet oppløst i diklormetan (DCM), opprettes det overflateaktive middel en barriere mellom fasene beskytte proteinet fra DCM. Denne emulsjon er enn dispergert i en annen vannfase som inneholder PVA for å lage den ytre overflaten av mikrokulene. Den stabile emulsjon blir omrørt for å tillate DCM til å fordampe. Etter skylling og lyofilisere er du igjen med tørre mikrosfærer fortsaining proteinet.

Etter sfærer er fullført de er klar til å bli elektrospunnede inn stillaser. Først du forberede electro løsning. Viskositeten av løsningen er kritisk for riktig fiberdannelse. Løsninger av ren HA ikke oppfyller dette kravet; PEO er tilsatt som en bærer polymer for å tillate elektrospinning. Mikrokulene blir tilsatt til oppløsningen og elektrospunnede resulterer i en fibrøs stillas med mikrosfærer fordelt i hele.

Når produksjonen er fullført, bør proteinet bli testet for å verifisere sin levedyktighet. For å gjøre dette, kan en primær celle som reagerer på NGF brukes. Denne protokollen bruker de dorsale nerveknutene (DRG) fra 8-10 dag gamle kylling embryoer. Cellen bunter sås på stillaser som inneholder mikrosfærer fylt med NGF eller de som er tom. Hvis NGF er fortsatt levedyktig bør du se forbedret neurite vekst på NGF inneholder stillaser. Dersom NGF ikke lenger er levedyktig det vilikke fremme neurites å utvide og bør ligne på kontrollen.

Den nøyaktige fremgangsmåte som er beskrevet heri er fokusert på nevrale støtte, men med enkle modifikasjoner av materialet, electro fremgangsmåte og proteiner kan systemet bli optimalisert for forskjellige celler og vevstyper.

Protocol

1. Vann / olje / vann-Double Emulsion mikrosfære Produksjon Først forberede 2% og 0,5% vekt / volum oppløsninger av polyvinylalkohol (PVA) i avionisert vann. Rør løsningene ved 50 ° C til klart, kan dette ta flere timer. Tilbered en oppløsning av 2% volum / volum isopropylalkohol i avionisert vann. Tilbered en vandig oppløsning av det ønskede hydrofile protein. Tabellen nedenfor gir eksempel formuleringer. <img alt="Tab…

Representative Results

Mikrokuler 50 ± 14 mikrometer i diameter med en over 85% protein innkapsling har vært konsekvent produsert og elektrospunnede i stillaser. Størrelse ble bestemt ved å avbilde prøver av mikrokuler fra tre separate produksjonspartier. Bildene der fanges opp på et optisk mikroskop og lengder, hvor målt ved bruk av kommersielt laboratorium programvare. Figur 1 viser et histogram av den størrelsesfordeling. Innkapsling Renten ble også testet fra tre separate mikrosfære partier, ved å tallfeste pro…

Discussion

Mange studier har vist at nerveceller kan bli regissert av topografiske signaler (fiber justering) og kjemiske signaler (vekstfaktorer) ^{1,2,10,11,35.} Elektrospinning er lettvinte metode for å lage innrettede fibre. Vekstfaktorer stimulere nervevekst, men for å inkludere dem i nerve ledninger (NC), er en fremgangsmåte for vedvarende frigjøring er nødvendig. Å skape et mer robust system med både pekepinner, bør disse to signalene kombineres. Flere metoder har blitt tidligere studert for å gi forlenget …

Materials

DAPI	Invitrogen	D1306
Irgacure 2959	BASF	24650-42-8	Protect from light
PEO 900 kDa	Sigma-Aldrich	189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B	Polysciences, Inc.	23591-100	Prepare stock solution in DMSO
Syringe Pump	KD Scientific	KDS100
Power Source	Gamma High Voltage	ES30P-5W
Motor	Triem Electric Motors, Inc	0132022-15	Must attach to a custom built mandrel
Tachometer	Network Tool Warehouse	ESI-330	Use to monitor mandrel speed
Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter	EXFO	S1000
Needles	Fisher Scientific	14-825-16H
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-81
Polyvinyl Alcohol	Sigma-Aldrich	P8136-250G
Isoporopyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9030-500mL
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9703-100
BSA-FITC	Sigma-Aldrich	080M7400
β-Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	1156-NG
65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA)	Sigma-Aldrich	1001554270
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	34856-2L
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Thermo Scientific	1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Sigma-Aldrich	1001558456
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006
DMEM	Lonza	12-604F
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Hyclone	SH30256.01
Glutamine	Fisher Scientific	G7513
Pen-Strep	Sigma-Aldrich	P4333
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	A11313