Electro tillväxtfaktor Släpper mikrosfärer i Fiber Ställningar
Summary
This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.
Abstract
This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.
Introduction
En av utmaningarna i neural tissue engineering skapar en nervledning (NC) som härmar extracellulära matrix, där nerverna växer naturligt. Forskning har visat att celler svarar på flera faktorer i sin omgivning, inklusive mekaniska, topografiska, lim och kemiska signaler 1-3. En av de främsta utmaningarna på detta område är att bestämma lämplig kombination av signaler och tillverka ett system som kan hålla ledtrådar under en längre period för att stödja tillväxten cell 4. Perifera nervceller är kända för att föredra en mjuk substrat, regisseras av inriktade fibrer och svara på nervtillväxtfaktorn (NGF) 5-7. NCs som kan ge kemiska signaler i veckor har visat sig ge förbättrad funktionell återhämtning närmare den för allografter, den nuvarande standarden för nervreparation 8,9.
Olika material och produktionsmetoder kan användas för att producera mekanisk och topografiskal Köer 10-13. Mekaniska ledtrådar är inneboende i det valda materialet, vilket gör valet av lämpliga material för tillämpningen kritiska 1,13. Produktionsmetoder för att styra topografiska ledtrådar inkluderar fasseparation, självorganisering och elektrospinning 1,13. För mikroskala applikationer, mikrofluidik, photopatterning, etsning, salt leaches eller gas skum kan också användas 14-17. Electro har blivit den mest populära sättet att konstruera fibrösa substrat för vävnadsodling på grund av dess flexibilitet och produktions 13,18-23. Elektrospunna Nanofiber tillverkas genom att tillämpa en hög spänning till en polymerlösning orsakar det att stöta bort sig själv och sträcker sig över en kort lucka att släppa 24. En linje byggnadsställning kan skapas genom att samla fibrerna på en jordad roterande spindel och alliansfria byggnadsställningar samlas på en stationär platta 25. Vidhäftning signalering kan åstadkommas genom att belägga det fibrösa scaffold with fibronektin eller konjugering av en vidhäftnings peptid, såsom RGD, till HA innan elektrospinning 26.
Kemiska signaler, såsom tillväxtfaktorer, är de svåraste att hålla under längre perioder eftersom de behöver en källa för kontrollerad frisättning. Många system har försökt att lägga till kontrollerad frisättning till elektrospunna fibrösa nätverk med varierande nivåer av framgång. Dessa metoder innefattar blandning electro, emulsion electro, core skal electro och proteinkonjugering 27. Dessutom är electro traditionellt görs i ett flyktigt lösningsmedel, vilket kan påverka lönsamheten av proteinet 28, alltså upprätthålla bioaktivitet av proteinet måste beaktas.
Detta tillvägagångssätt tar specifikt kombinerar mekaniska, topografiska, kemiska och självhäftande signaler för att skapa en avstämbar klätterställning för perifer nervtillväxt. Scaffold mekanik är exakt styrd av syntetiserametakrylerad hyaluronsyra (HA). De methacrylation ställen används för att fästa fotoreaktiva tvärbindare. Det tvärbundna materialet inte längre är vattenlösliga och uteslutande fördelade på enzymer 29. Mängden tvärbindning förändrar nedbrytningshastigheten, mekanik och andra fysikaliska egenskaper hos materialet. Använda HA med 30% methacrylation, som har en dragmodul av ~ 500 Pa, skapar en mjuk underlag som ligger nära de infödda mekanik nervvävnad och är vanligtvis föredras av nervceller 26,29. Electro på en roterande dorn används för att skapa inriktade fibrer för en topografisk cue. Använda electro tillsammans med mikrosfärer ger kemiska signaler inom byggnadsställning under längre perioder. För att stödja neurite tillväxtmikrosfärer innehållande NGF används för att skapa den kemiska signalen. Till skillnad från de flesta elektrospunna material HA är löslig i vatten så att NGF inte möter starka lösningsmedel under produktionen. För att lägga till en klistersignal, scaffold är belagd med fibronektin. Den färdiga systemet innehåller alla fyra typer av signaler som beskrivs ovan: mjuka (mekaniska) linje (topografiska) fibrer med NGF släppa mikrosfärer (kemisk) belagd med fibronektin (lim). Produktion och testning av detta system beskrivs i detta protokoll.
Processen börjar med framställning av mikrosfärerna med en vatten-i-olja-i-vatten dubbelemulsion. Emulsionen stabiliseras med ett ytaktivt medel, polyvinylalkohol (PVA). Den inre vattenfasen innehåller proteinet. Såsom den sättes till oljefasen, innehållande PLGA skalmaterialet upplöstes i diklormetan (DCM), skapar det ytaktiva medlet en barriär mellan faserna som skyddar proteinet från DCM. Denna emulsion är än dispergerad i en annan vattenfas innehållande PVA för att skapa den yttre ytan av mikrosfärerna. Den stabila emulsionen omröres för att tillåta DCM avdunsta. Efter sköljning och frystorkning du är kvar med den torra mikrosfärer fortsaining proteinet.
Efter att mikrosfärerna är avslutade de är redo att Electrospun i byggnadsställningar. Först förbereder electrolösningen. Viskositeten för lösningen är kritisk för korrekt fiberbildning. Lösningar av ren HA uppfyller inte detta krav; PEO tillsätts som en bärarpolymer för att möjliggöra elektrospinning. Mikrosfärerna sattes till lösningen och electrospun vilket resulterar i en fibrös scaffold med mikrosfärer fördelade i hela.
När produktionen är klar, bör proteinet testas för att kontrollera dess lönsamhet. För att göra detta, kan en primär cell som svarar på NGF användas. Detta protokoll använder dorsalrotsganglier (DRG) 8-10 dagar gamla kycklingembryon. Cell buntar sås på byggnadsställningar mikrosfärer fyllda med NGF eller de som är tomma. Om NGF fortfarande lönsamt bör du se förbättrade neurite tillväxt på NGF innehåller byggnadsställningar. Om NGF inte längre är lönsamt kommer detMarknadsför inte neurites att utvidga och borde likna kontrollen.
Det exakta förfarandet som beskrivs här är inriktad på neural stöd, dock med enkla ändringar av materialet, elektrospinning metod och proteiner systemet kan optimeras för olika cell och vävnadstyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många studier har visat att nervceller kan regisseras av topografiska ledtrådar (fiberinriktnings) och kemiska signaler (tillväxtfaktorer) 1,2,10,11,35. Electro är en enkel metod för att skapa inriktade fibrer. Tillväxtfaktorer stimulera nervtillväxt men för att inkludera dem i nervledningar (NC), krävs en metod för fördröjd frisättning. För att skapa ett mer robust system med både ledtrådar, bör dessa två signaler kombineras. Flera metoder har tidigare studerat för att ge förlängd frisä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded through the Richard Barber Foundation and a Thomas Rumble Fellowship (TJW).
Materials
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O’Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. . The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition – 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -. W. Electrospinning technology in tissue regeneration. Methods Mol. Biol. 811, 127-140 (2012).
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -. I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O’Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. . Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -. Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -. J., Wang, C. -. Y., Wang, J. -. G., Ruan, H. -. J., Fan, C. -. Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
