二光子<em> in vivoで</em>間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
哺乳類の大脳皮質では、神経細胞がシナプスで非常に複雑なネットワークや情報交換を形成している。シナプス強度、ならびにシナプスの追加/削除の変化は、神経可塑性の構造的基礎を提供する、経験依存的な様式で起こる。大脳皮質で最も興奮性シナプスのシナプス後構成要素として、樹状突起棘はシナプスの良いプロキシであると考えられている。マウス遺伝学および蛍光標識技術、個々のニューロンのシナプスの構造およびそれらの撮影の利点は、無傷の脳内で標識することができる。ここでは、 生体内での経時的蛍光標識後シナプス樹状突起棘に追従する二光子レーザー走査顕微鏡を用いて、経頭蓋撮影プロトコルを導入する。このプロトコルは、完全な頭蓋骨を保持し、髄膜および皮質の曝露によって引き起こされる炎症作用を回避間引き頭蓋骨の準備を利用する。そのため、画像はSUの直後に取得することが可能rgeryが実行されます。実験手順は、数時間から数年の範囲の様々な時間間隔で繰り返し行うことができる。この調製物の適用はまた、生理学的および病理学的条件下で、異なる皮質領域、層、ならびに他の細胞型を調査するために拡張することができる。
Introduction
哺乳類の大脳皮質は、知覚と運動制御から抽象情報処理や認知に、多くの脳機能に参加しています。種々の皮質の機能は、個々のシナプスで情報を通信し、交換する異なるタイプのニューロンから構成されている異なる神経回路上に構築。シナプスの構造および機能は、一貫して経験や病状に応じて変更される。成熟した脳では、シナプス可塑性、機能性神経回路の形成と維持に重要な役割を果たして、両方の強さが変化し、シナプスの追加/削除の形をとる。樹状突起棘は、哺乳類の脳における興奮性シナプスの大多数のシナプス後要素である。一定の売上高および棘の形態学的変化は、シナプス結合1-7において変更が良い指標となると考えられている。
二光子レーザー走査マイクロSCOPYは厚く、不透明な準備と、無傷の脳8でのライブイメージングのために適しています、低光毒性を通じて深い浸透を提供しています。蛍光標識との組み合わせでは、2光子イメージングは、生きている脳に覗くと、高い空間分解能と時間分解能を有する個々のシナプスにおける構造的な再編成を追跡する強力なツールを提供しています。様々な方法がライブイメージングのために9-13匹のマウスを作製するために使用されている。ここでは、マウスの皮質におけるシナプス後樹状突起棘の構造的可塑性を調べるためのin vivo二光子イメージングの間引き頭蓋骨の調製を記載する。このアプローチを使用して、我々の最近の研究では、蛍光標識された神経細胞のサブセットおよびin vivo標識技術の急速な発展に伴い、トランスジェニック動物の増加可用性を使用した学習運動技能に応じて、樹状突起棘の変更のダイナミックな絵を描かれているが、ここで説明するのと同様の手順を適用することもできますinvestigaへteの他の細胞型および皮質領域、他の操作と組み合わせ、ならびに疾患モデル16-23で使用した。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功間引き頭蓋骨の準備を取得するには、このプロトコルにはいくつかのステップが重要である。 1）頭蓋骨の厚さ。頭蓋骨は、高密度緻密骨と低密度海綿骨の中間層の2層、サンドイッチ構造を有する。高速マイクロドリルは緻密骨と海綿骨の外側の層を除去するのに適しているが、顕微ブレードは緻密骨の内側の層を薄くするのに最適です。開発中に頭蓋骨の厚さが増加すると剛性ように?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、図解のためにジェームス·ペルナに感謝します。この作品は、YZに国立精神衛生研究所からの補助金によって支えられて
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
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