Een stap Zuivering van Twin-Strep-gelabeld eiwitten en hun complexen op Strep-Tactin Resin Cross-linked met bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3)
Summary
Een werkwijze wordt beschreven voor een efficiënte zuivering van twin-Strep-gemerkte fusie-eiwitten en hun specifieke complexen van gemodificeerde streptavidine (Strep-Tactin) hars covalent verknoopt met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3). De methode heeft de voordelen van hoge snelheid, goede doeleiwit terugwinning en hoge zuiverheid, en is compatibel met daaropvolgende analyse door massaspectrometrie.
Abstract
Affiniteitszuivering van Strep-gemerkte fusie-eiwitten op harsen dragen een aangelegde streptavidine (Strep-Tactin) is uitgegroeid tot een veel gebruikte methode voor de isolatie van eiwitcomplexen onder fysiologische omstandigheden. Fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, hebben het voordeel van hogere affiniteit voor Strep-Tactin in vergelijking met degenen die slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiënter eiwitreiniging. Echter dit voordeel gecompenseerd doordat elutie twin-Strep-gemerkte eiwitten met biotine onvolledig zijn, leidt tot lage eiwit herstel. Het herstel kan drastisch worden verbeterd door denaturerende elutie met natriumdodecylsulfaat (SDS), maar dit leidt tot verontreiniging met Strep-Tactin afgegeven uit de hars monster, waardoor de bepaling onverenigbaar met downstream proteoomanalyse. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij een methode waarbij hars gekoppeld tetrameer van Strep-Tactin ontwikkeldwordt eerste gestabiliseerd door covalente verknoping met Bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) en het verkregen verknoopte hars wordt vervolgens gebruikt om doeleiwit complexen te zuiveren in een enkele batch zuiveringsstap. Efficiënte elutie met SDS zorgt voor een goede eiwit herstel, terwijl de afwezigheid van verontreinigende Strep-Tactin laat stroomafwaarts eiwit analyse door massaspectrometrie. Als een proof of concept, beschrijven we hier een protocol voor de zuivering van SIII-getagde viraal eiwit VPG-Pro van kernen van virus-geïnfecteerde N. benthamiana installaties die het Strep-Tactin polymethacrylaathars verknoopt met BS3. Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om een twee-Strep-gelabeld eiwit van belang te zuiveren en te karakteriseren zijn fysiologische bindingspartners.
Introduction
In de afgelopen jaren heeft Strep-tag technologie op grote schaal gebruikt worden in veel gebieden van het biomedisch onderzoek, met inbegrip van proteomics en structurele biologie. Deze eiwitzuivering technologie, die gebaseerd is op de fusie van recombinante eiwitten een korte Strep-tag peptide, gerijpt met de komst van affiniteitsmatrices uitvoering Strep-Tactin, een genetisch gemanipuleerde variant van streptavidine met verbeterde peptide-bindingscapaciteit. 1, 2 fusie-eiwitten die twee kopieën van Strep-tag II, aangeduid twin-Strep-tag of SIII-tag, vertonen een hogere affiniteit voor Strep-Tactin matrices dan die met slechts een enkele Strep-tag, waardoor efficiëntere zuivering van de recombinante eiwitten en bijbehorende bindingspartners. Echter, de hogere affiniteit van twin-Strep-gemerkte eiwitten om Strep-Tactin heeft ook zijn keerzijde. Concurrerende elutie van dergelijke eiwitten met overmaat biotine kan onvolledig zijn, waardoor doeleiwit rendement gedaald. Een merts efficiënt alternatief is elutie met SDS, maar het leidt tot ongewenste verontreiniging met monster Strep-Tactin afgegeven uit het hars, waardoor de bepaling onverenigbaar met proteoomanalyse. Dit document presenteert een techniek om deze beperking te overwinnen door eerst het stabiliseren van de hars-gekoppelde tetrameer van Strep-Tactin door chemische cross-linking en vervolgens met behulp van SDS naar twin-Strep-gemerkte eiwitten en hun bijbehorende complexen uit de resulterende verknoopte hars elueren. Zo kan voldoende eiwit opbrengst worden bereikt zonder monster besmetting met Strep-Tactin, waardoor verdere analyse met behulp van massaspectrometrie.
De methode is geschikt voor de zuivering van een recombinant fusie-eiwit met een oppervlak blootgestelde SIII-tag 3 of twin-Strep-tag (aminozuurvolgorde WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK en SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, respectievelijk). Het eiwit kan van dierlijke, plantaardige of bacteriële oorsprong zijn en kunnen worden geïsoleerd uit zowel de totale cellysaat of verrijkte organel fractie. Als voorbeeld beschrijven we hier de zuivering van een SIII-gemerkt eiwit VPG-Pro Aardappel Virus A (PVA) 4 van de nucleaire fractie van PVA-geïnfecteerde Nicotiana benthamiana planten. De nucleaire fractie werd geïsoleerd zoals eerder beschreven 5 met de volgende wijzigingen: cellen werden niet behandeld met formaldehyde, werd natrium butyraat gesubstitueerd alle buffers met 5 mM natriumfluoride, werd volledige proteaseremmer gesubstitueerd met PMSF, Triton X-100 concentratie extractie buffer # 2 werd verlaagd tot 0,3% (v / v) en de nucleaire pellet verkregen door centrifugatie door sucrosekussen (extractiebuffer # 3) werd geresuspendeerd in 1,45 ml voorgekoeld bindingsbuffer en geroteerd gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. De resulterende nucleaire extract dat de SIII-gelabeld aas eiwit en bijbehorende complexen (aas eiwit monster) werd verwerkt volgens de hieronder beschreven (zie punt 2) protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bovenstaande protocol kan worden gebruikt om een twee-Strep-gelabeld aas eiwit van interesse en de bijbehorende complexen in elke geschikte buffer die niet biotine of sterke denatureringsmiddelen bevat zuiveren. In de huidige versie van het protocol, bindende en wassen wordt uitgevoerd onder relatief stringente omstandigheden in de aanwezigheid van hoge zoutconcentratie en niet-ionisch detergens. Hoewel dit leidt tot minder achtergrond, kan breekbare eiwitcomplexen dissociëren onder deze omstandigheden. Om de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij dankbaar erkennen de technische ondersteuning van Sini Miettinen, Minna Pöllänen en Taru Rautavesi. Wij danken Helka Nurkkala voor het verstrekken van HEK 293 cellen die twin-Strep-gelabeld GFP en Pekka Evijärvi voor het verstrekken van geluidsopname-apparatuur. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland, verlenen nummers 138329, 134684 en 258978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
