One-step purificazione di proteine Twin-Strep-taggate e dei loro complessi su Strep-Tactin resina reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3)
Summary
Un metodo è descritto per la purificazione efficiente di proteine di fusione twin-Strep-tag e dei loro complessi specifiche in materia di streptavidina modificato (Strep-Tactin) resina covalentemente reticolato con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3). Il metodo ha i vantaggi di velocità veloce, buon recupero proteina bersaglio ed elevata purezza, ed è compatibile con la successiva analisi mediante spettrometria di massa.
Abstract
Purificazione per affinità di proteine di fusione Strep-targhetta di resine che trasportano una streptavidina allestita (Strep-Tactin) è diventato un metodo ampiamente utilizzato per l'isolamento di complessi proteici in condizioni fisiologiche. Proteine di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, hanno il vantaggio di una maggiore affinità per Strep-Tactin rispetto a quelli che contengono un solo Strep-tag, permettendo così più efficiente purificazione di proteine. Tuttavia, questo vantaggio è compensato dal fatto che eluizione delle proteine twin-Strep-taggate con biotina può essere incompleta, portando a basso recupero di proteine. Il recupero può essere notevolmente migliorata utilizzando denaturazione eluizione con sodio dodecil solfato (SDS), ma questo porta a campionare contaminazione con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il saggio incompatibile con analisi proteomica valle. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo in base al quale tetramero resina accoppiata di Strep-Tactinè prima stabilizzato da covalente reticolazione con Bis (Sulfosuccinimidil) suberato (BS3) e la resina reticolata risultante viene poi utilizzato per purificare bersaglio complessi proteici in un singolo passaggio di purificazione batch. Eluizione efficiente con SDS assicura buon recupero proteina, mentre l'assenza di contaminazione Strep-Tactin permette valle proteina analisi mediante spettrometria di massa. Come un proof of concept, descriviamo qui un protocollo per la purificazione della proteina virale SIII-tagged VPG-Pro da nuclei di N. infettato da virus piante benthamiana utilizzando la resina di polimetacrilato Strep-Tactin reticolato con BS3. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi proteina twin-Strep-tag di interesse e caratterizzare suoi partner di legame fisiologiche.
Introduction
Negli ultimi anni, la tecnologia Strep-tag è stato ampiamente utilizzato in molti settori della ricerca biomedica, tra cui la proteomica e la biologia strutturale. Questa tecnologia purificazione della proteina, che si basa sulla fusione di proteine ricombinanti ad una breve Strep-tag peptide, è maturata con l'avvento di matrici di affinità che trasportano Strep-Tactin, una variante geneticamente di streptavidina con una migliore capacità di legame peptidico. 1, 2 proteine di fusione contenenti due copie di Strep-tag II, designate twin-Strep-tag o SIII-tag, mostrano una maggiore affinità per le matrici Strep-Tactin di quelli contenenti un solo Strep-tag, garantendo la depurazione più efficiente delle proteine ricombinanti e i loro partner di legame associate. Tuttavia, la maggiore affinità delle proteine twin-Strep-tagged per Strep-Tactin ha anche il suo rovescio della medaglia. Eluizione concorrenziale di tali proteine con eccesso di biotina può essere incompleta, con conseguente riduzione della resa di proteine bersaglio. A mminerale efficiente alternativa è eluizione con SDS, ma porta alla contaminazione del campione indesiderato con Strep-Tactin rilasciato dalla resina, rendendo il test incompatibile con l'analisi proteomica. Questo articolo presenta una tecnica per superare questa limitazione prima stabilizzazione del tetramero resina accoppiata di Strep-Tactin dal chimico cross-linking e quindi utilizzando SDS per eluire le proteine twin-Strep-taggate e dei loro complessi associati dalla risultante resina reticolata. Così, sufficiente resa di proteine può essere realizzata senza contaminazione del campione con Strep-Tactin, consentendo così un'ulteriore analisi mediante spettrometria di massa.
Il metodo è adatto per la purificazione di una proteina di fusione ricombinante con un SIII-tag-superficie esposta 3 o twin-Strep-tag (WSHPQFEK sequenza aminoacidica (GGGS) 3 WSHPQFEK e SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, rispettivamente). La proteina può essere di origine animale, vegetale o batterica e può essere isolato da entrambi cellulare totalelisato o frazione organello arricchito. Come esempio, si descrive qui la purificazione di una proteina SIII-tag VPG-Pro di Potato virus A (PVA) 4 dalla frazione nucleare di PVA-infettati Nicotiana benthamiana. La frazione nucleare è stato isolato come descritto in precedenza 5, con le seguenti modifiche: cellule non sono state trattate con formaldeide, butirrato di sodio è stato sostituito in tutti i buffer con fluoruro di sodio 5 mM, inibitore della proteasi completo è stato sostituito con PMSF, Triton X-100 in concentrazione estrazione tampone # 2 è stato ridotto al 0,3% (v / v) e il pellet nucleare ottenuto mediante centrifugazione attraverso cuscino di saccarosio (tampone di estrazione # 3) è stato risospeso in 1,45 ml di tampone di legame pre-raffreddata e ruotata per 1,5 ore a 4 ° C. L'estratto nucleare risultante contiene la proteina esca SIII-tag e complessi associati (campione proteina esca) è stato elaborato secondo il protocollo descritto di seguito (vedere paragrafo 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra può essere usato per purificare qualsiasi proteina esca twin-Strep-tag di interesse e suoi complessi associati in qualsiasi tampone adatto che non contiene biotina o denaturanti forti. Nella versione attuale del protocollo, vincolante e lavaggio vengono eseguiti in condizioni relativamente restrittive in presenza di elevata sale e detergente non ionico. Anche se questo si traduce in meno sfondo, complessi proteici fragili possono dissociare in queste condizioni. Per conservare tali complessi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine il supporto tecnico di Sini Miettinen, Minna Pollanen e Taru Rautavesi. Ringraziamo Helka Nurkkala per la fornitura di cellule HEK 293 esprimenti twin-Strep-tag GFP e Pekka Evijärvi per la fornitura di apparecchi registrazione suono. Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia di Finlandia, concedere numeri 138.329, 134.684 e 258.978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
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