Ett-trinns Rensing av Twin-streptokokk-merket Proteiner og deres Komplekser for streptokokk-Tactin Resin tverrbundet Med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3)
Summary
En fremgangsmåte er beskrevet for effektiv rensing av en tvilling-Strep-merkede fusjonsproteiner og deres spesifikke komplekser på modifisert streptavidin (Strep-Tactin) harpiks kovalent kryssbundet med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3). Fremgangsmåten har fordelen med høy hastighet, god målprotein utvinning og høy renhet, og er forenlig med etterfølgende analyse ved massespektrometri.
Abstract
Affinitetsrensing av streptokokk-merkede fusjonsproteiner på harpiks bærer en konstruert streptavidin (Strep-Tactin) har blitt en mye brukt metode for isolering av protein komplekser under fysiologiske forhold. Fusjon proteiner inneholder to kopier av streptokokk-tag II, utpekte twin-streptokokk-tag eller SIII-tag, har fordelen av høyere affinitet for streptokokk-Tactin sammenlignet med dem som bare inneholder en enkelt Strep-tag, og dermed gir mer effektiv protein rensing. Imidlertid er denne fordel oppveies av det faktum at eluering av tvilling-Strep-merkede proteiner med biotin kan være ufullstendig, noe som fører til lav proteingjenvinning. Utvinningen kan bli dramatisk forbedret ved bruk av denaturerende eluering med natriumdodecylsulfat (SDS), men dette fører til forurensning av prøven med Strep-Tactin frigjøres fra harpiksen, noe som gjør analysen uforenlig med nedstrøms proteomikk analyse. For å overkomme denne begrensningen, har vi utviklet en metode der harpiks-coupled tetramer av streptokokk-Tactinblir først stabilisert ved kovalent tverrbinding med Bis (sulfosuccinimidyl) suberat (BS3) og den resulterende tverrbundne harpiks blir så brukt til å rense mål-protein komplekser i en enkel batch-rensetrinn. Effektiv eluering med SDS sikrer god proteingjenvinning, mens fraværet av forurensende Strep-Tactin tillater nedstrøms protein-analyse ved massespektrometri. Som et bevis på konseptet, beskriver vi her en protokoll for rensing av SIII-merket viral protein VPG-Pro fra kjerner av virusinfisert N. benthamiana planter ved hjelp av streptokokk-Tactin polymethacrylate harpiks tverrbundet med BS3. Den samme protokoll kan benyttes for å rense ethvert tvilling-Strep-merket protein av interesse og å karakterisere dets fysiologiske bindingspartnere.
Introduction
I de senere årene har streptokokk-tag teknologien blitt mye brukt i mange områder av biomedisinsk forskning, inkludert proteomikk og strukturbiologi. Dette proteinet renseteknologi, som er avhengig av sammensmeltingen av rekombinante proteiner til en kort streptokokk-tag peptid, har modnet med bruk av affinitet matriser bærer streptokokk-Tactin, en genmodifisert variant av streptavidin med forbedret peptid bindingskapasitet. 1, 2 fusjon proteiner inneholder to kopier av streptokokk-tag II, utpekte twin-streptokokk-tag eller SIII-tag, utstillings en høyere affinitet for streptokokk-Tactin matriser enn de som inneholder bare en enkelt Strep-tag, noe som sikrer mer effektiv rensing av rekombinante proteiner og tilhørende bindende partnere. Imidlertid har høyere affinitet for twin-streptokokk-merkede proteiner til streptokokk-Tactin også sine ulemper. Kompetitiv eluering av slike proteiner med overskudd biotin kan være ufullstendig, noe som fører til redusert målprotein utbytte. En more effektiv alternativ er eluering med SDS, men det fører til uønsket forurensning av prøven med Strep-Tactin frigjøres fra harpiksen, noe som gjør analysen uforenlig med proteomikk analyse. Dette papir presenterer en teknikk for å overvinne denne begrensningen ved først å stabilisere harpiksen koplet tetramer av Strep-Tactin ved kjemisk tverrbinding, og deretter ved hjelp av SDS for å eluere twin-Strep-merkede proteiner og deres tilhørende kompleksene fra den resulterende tverrbundne harpiks. Således kan tilstrekkelig protein utbytte oppnås uten kontaminering av prøver med Strep-Tactin, for derved å tillate ytterligere analyse ved massespektrometri.
Fremgangsmåten er egnet for rensing av en hvilken som helst rekombinant fusjonsprotein med et overflateeksponert SIII-taggen tre-eller tvilling-Strep-tag (aminosyresekvens WSHPQFEK (GGGS) 3 WSHPQFEK og SAWSHPQFEK (GGGS) 2 GGSAWSHPQFEK, henholdsvis). Proteinet kan være av animalsk, plante eller bakteriell opprinnelse, og kan isoleres fra enten total cellelysatet eller beriket organelle brøkdel. Som et eksempel, beskrives her for rensing av en SIII-kodet protein VPG-Pro for potetvirus A (PVA) 4 fra atomfraksjonen av PVA-infiserte Nicotiana benthamiana planter. Atom fraksjonen ble isolert som tidligere beskrevet 5, med de følgende modifikasjoner: celler ble ikke behandlet med formaldehyd, er natrium-butyrat substituert i alle buffere med 5 mM natriumfluorid, var komplett protease-inhibitor substituert med PMSF, Triton X-100 konsentrasjonen i ekstraksjon buffer nr. 2 ble senket til 0,3% (v / v), og den nukleære pellets erholdt ved sentrifugering gjennom sucrose pute (ekstraksjon buffer nr. 3) ble på nytt oppslemmet i 1,45 ml av pre-kjølt bindingsbuffer og rotert i 1,5 timer ved 4 ° C. Den resulterende atom ekstrakt inneholder SIII-merket agn protein og tilhørende komplekser (agn protein utvalget) ble behandlet i henhold til protokollen beskrevet nedenfor (se punkt 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovennevnte protokollen kan brukes for å rense alle tvilling-Strep-merket agn protein av interesse og dens tilhørende kompleksene i en hvilken som helst egnet buffer som ikke inneholder biotin eller sterke denatureringsmidler. I den nåværende versjonen av protokollen, binding og vasking utføres under relativt strenge vilkår i nærvær av høy salt og ikke-ionisk vaskemiddel. Selv om dette resulterer i mindre bakgrunn, kan skjøre proteinkomplekser dissosiere under disse forhold. For å ta vare på slike lavere affi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner takknemlig teknisk støtte av Sini Miettinen, Minna Pöllänen og Taru Rautavesi. Vi takker Helka Nurkkala for å gi HEK 293 celler uttrykker twin-streptokokk-merket GFP og Pekka Evijärvi for å gi lyd opptaksutstyr. Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland, gi tall 138329, 134684 og 258978.
Materials
| Bis(sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), No-Weigh format, 8 x 2mg | Pierce/Thermo Scientific | 21585 | www.fishersci.com CAUTION: Hazardous substance. Causes serious respiratory, skin and eye irritation. Wear protective gloves and eye protection. |
| Strep-Tactin MacroPrep resin (50% suspension) | IBA | 2-1505 | www.iba-lifesciences.com |
| Spin-X centrifuge tube filter, cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, non-sterile | Costar (Corning) | 8163 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Dolphin-nose tubes | Costar (Corning) | 3213 | www.corning.com/lifesciences/ |
| Avidin | IBA | 2-0204 | www.iba-lifesciences.com |
References
- Voss, S., Skerra, A. Mutagenesis of a flexible loop in streptavidin leads to higher affinity for the Strep-tag II peptide and improved performance in recombinant protein purification. Protein Eng. 10 (8), 975-982 (1997).
- Schmidt, T. G., Skerra, A. The Strep-tag system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat. Protoc. 2 (6), 1528-1535 (2007).
- Junttila, M. R., Saarinen, S., Schmidt, T., Kast, J., Westermarck, J. Single-step Strep-tag purification for the isolation and identification of protein complexes from mammalian cells. Proteomics. 5 (5), 1199-1203 (2005).
- Hafren, A., Hofius, D., Ronnholm, G., Sonnewald, U., Makinen, K. HSP70 and its cochaperone CPIP promote potyvirus infection in Nicotiana benthamiana by regulating viral coat protein functions. Plant Cell. 22 (2), 523-535 (2010).
- Jaskiewicz, M., Peterhansel, C., Conrath, U. Detection of histone modifications in plant leaves. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Witte, C. P., Noel, L. D., Gielbert, J., Parker, J. E., Romeis, T. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol. 55 (1), 135-147 (2004).
- Werner, A. K., Sparkes, I. A., Romeis, T., Witte, C. P. Identification, biochemical characterization, and subcellular localization of allantoate amidohydrolases from Arabidopsis and soybean. Plant Physiol. 146 (2), 418-430 (2008).
- Panwar, P., Deniaud, A., Pebay-Peyroula, E. Contamination from an affinity column: an encounter with a new villain in the world of membrane-protein crystallization. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 68 (10), 1272-1277 (2012).
- Hendrickson, W. A., et al. Crystal structure of core streptavidin determined from multiwavelength anomalous diffraction of synchrotron radiation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (7), 2190-2194 (1989).
- Bernot, K. M., Lee, C. H., Coulombe, P. A. A small surface hydrophobic stripe in the coiled-coil domain of type I keratins mediates tetramer stability. J. Cell Biol. 168 (6), 965-974 (2005).
- Singh, I., et al. Solution structure of human von Willebrand factor studied using small angle neutron scattering. J. Biol. Chem. 281 (50), 38266-38275 (2006).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5 (9), (2010).
- Wang, W., Barger, S. W. Roles of quaternary structure and cysteine residues in the activity of human serine racemase. BMC Biochem. 12, 63 (2011).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J. Struct. Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sousa, M. M., Steen, K. W., Hagen, L., Slupphaug, G. Antibody cross-linking and target elution protocols used for immunoprecipitation significantly modulate signal-to noise ratio in downstream 2D-PAGE analysis. Proteome Sci. 9, 45 (2011).
