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Bioengineering

单个RNA分子的光镊纳米操作

Published: August 20, 2014
doi:
10.3791/51542
, , ,
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute,University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences,University at Albany, State University of New York

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

人类基因组中有很大一部分被转录，但没有翻译。在这篇文章中基因组时代，RNA的调节功能已被证明是越来越重要。作为RNA的功能，通常取决于其采用替代的结构的能力，它是很难直接从序列预测RNA的三维结构。单分子方法展示潜能监测分子结构一个分子在同一时间，解决了RNA的结构多态性的问题。这项工作提出了一种方法，能够精​​确地操控利用光学镊子单个RNA分子的折叠和结构。首先，方法以合成适于单分子机械功分子中描述。接着，各个校准程序，以确保所述光学镊子的正确操作进行了讨论。接着，不同的实验进行说明。为了证明该技术的实用性，机械地展开发夹RNA的结果和一个RNA的亲吻克复合体作为证据使用。在这些例子中，纳米操作技术被用来研究每个结构域，其中包括二级和三级折叠，独立。最后，在限制和方法的未来的应用进行了讨论。

Introduction

光学镊子技术的发展早已伴随其在生物研究中的应用。当第一次被发现的光学捕获效应，亚瑟Ashkin观察到细菌污染的水可以在激光焦点1被困住。此后，细菌诱捕已经成为一个意外的，有趣的实验几代生物物理的学生，以及一个严肃的研究工具，研究微生物生理学2,3。光诱捕技术使用聚焦激光束来固定微观对象1。实际上，激光陷阱功能的光学弹簧，其中还通过从陷阱（ΔX）的中心，它的位移测量捕获对象上的力（F）。在很短的范围内，F =κ点¯xΔX，在κ是陷阱的弹簧常数。在光阱可以用来施加在picoNewton（PN）精密力为百万分之一COPIC物体并测量其与纳米精度的位置。在过去的二十年中，光学镊子已经成为生物物理学中最常用的单分子技术中的一种。该技术已用于研究的折叠和DNA 4-6，7-9的RNA和蛋白质10,11力学。光学镊子也已用于观察DNA复制12，RNA转录13，和蛋白合成14,15，以及许多其它生物分子事件16-18。

单分子的方法是采用RNA的结构研究主要探讨RNA的折叠崎岖的能源格局。的RNA序列通常可以折叠成多个稳定，互斥的结构中，由于RNA的简单的化学组合物和碱配对规则。人们早已知道，RNA结构的多态性，如发生在核糖开关19,20，起着基因调控中起重要作用。 àrecen吨全基因组的调查显示，温度变化小到几度极大地影响结构和蛋白质合成的细胞转录组21一 ​​大截。这个例子暗示的替代RNA折叠的生物学作用可能更为重要和普遍比以前承担。结构多态性，但是，带来了传统的生物化学和生物物理的方法，其中许多研究分子的平均性能是一个挑战。例如，在“开”和核开关的“关”的构象是相互排斥的。从异质结构衍生的平均结构不太可能像任生物学相关的构象异构体。此外，非编码RNA和mRNA的一般形式结构。它们与蛋白质和调控RNA的相互作用通常需要现有结构的展开作为交互的一部分。因此，研究RNA的折叠/折叠成为相关问题的RNA生物学。为了迎接这样的挑战，在单分子的方法已被用来通过研究一个分子在同一时间22-27解开RNA的结构多态性。

较流行的单分子荧光法，基于机械展开镊子提供了单个分子的构象，可以通过施加力来操纵并与纳米精度测量的优点。这种纳米操作能力可被利用来监视单个结构域，使得大量的RNA的分层折叠可解剖28的解折叠/折叠。备选地，单链，可向折叠成若干构象之一;或现有结构可以机械地诱导重新折叠成不同的构象29。根据生物的条件下，一种RNA结构可以根据温度变化或配体结合结构被改变。直接操纵分子S中的能力tructure打开一个新场地的RNA结构的研究。原则上，其它机械技术，例如原子力显微镜和磁镊子，也可以用于研究单个RNA分子的折叠。但是，这样的应用在很大程度上限于由于相对低的空间分辨率30。

光镊的就业使RNA结构受机械力来展开。

机械折叠的优点是数倍。力可以用来展现两个二级和三级结构，而金属离子和配体诱导的折叠主要限于三级结构。温度和变性剂可以显著影响水和溶质的活动。与此相反，力局部地施加于扰动的分子结构;的力对周围环境的影响是可以忽略不计。此外，热熔最好用于研究小分子RNA折叠结构热力学，而光学镊子已用于研究RNA结构，各种大小不等的7个碱基对tetraloop发卡28至400个核苷酸的核酶31。此外，RNA结构可以机械地展开在嗜温温度。与此相反，以展开的RNA中的热熔融实验中，温度通常升高远高于生理温度，这显著增加RNA的水解，特别是在Mg 2 +的离子的存在。

要注意的力的机械作用取决于它是如何施加到结构是很重要的。作用力倾斜折叠能源格局。例如，当力被施加到一个发夹，基地对被顺序地破碎，每次一个（ 图1a）。翻录叉前进沿着螺旋轴，其垂直于所施加的力。相反，当一个最小接吻络合物是在张力下，两亲碱基对，它们平行于所施加的力，共享的力负载（ 图1b）。不同几何形状的发夹，亲吻复杂相对于所施加的力导致在其不同的力学响应，这可以被用来区分二级和三级折叠28,32的。机械展开的理论方面先前已审查8,9,30。这项工作概括了基本的方法建立并执行单分子机械展开分析。

实验装置 。在我们的机械拉力实验中，对于如何运用眼线改变RNA样品由目的RNA由两个双链DNA / RNA的把手侧接（ 图2）的7。整个分子可被拴经由链霉亲和素 – 生物素和地高辛抗地高辛抗体相互作用，两个分别的表面被覆的微米尺寸的小珠（Spherotech）。一个珠子是由测力光TR举行AP，而另一种是举行微量的一角。小珠之间的相对距离可以通过操纵陷阱或移动的微量改变。使用这种方法，单个RNA分子圈养珠可以拉伸和放松。

样品的制备 。 RNA样品的合成对于如何运用眼线改变包括几个步骤（ 图3）。首先，对应于感兴趣的RNA的DNA序列，首先克隆到质粒载体中。接下来，三PCR反应进行，生成两个手柄和转录的模板。转录模板包括手柄区域和插入序列。全长RNA通过体外转录合成。最后，该RNA和化学修饰的手柄一起退火，以产生所述分子为如何运用眼线改变。

校准和镊子的操作 。在Minitweezers使用的基本设计d在此工作如下的双光束光镊33。有许多改进，Minitweezers相比第一代光学镊子显示非常稳定。一些研究小组在几个国家使用Minitweezers在他们的单分子研究14,15,34-37。建筑设备，包括教学影片，校准和操作的细节，都可以在“镊子实验室”网站（http://tweezerslab.unipr.it）。这里，需要在每日基础进行改进和校准程序进行详细说明。

Protocol

1，制备RNA分子的单分子如何运用眼线改变克隆的目的序列。克隆对应于RNA的结构到载体的DNA序列。 合成与转录模板的净化。合成通过PCR转录模板。 [地方表1这里]接下来，净化用PCR纯化试剂盒PCR产物，集中了样品> 200毫微克/微升。因为纯化的DNA用于转录，无RNA酶的水应在洗脱和浓缩步骤中使用。 体外转录。合成通过体外转录的RNA在37℃下过夜，以最大限度地?…

Representative Results

受空间限制，单个RNA分子的纳米操纵的证明显示的RNA发夹只是机械展开的例子，并与三级结构的RNA。 操纵单分子发夹 一旦系绳珠粒之间建立，扩展和力上的系绳可以使用用户定义的协议进行操作。四种常见的操作协议是常用的。 强制斜坡实验 。最直观和通用实验操纵的单个RNA是反复拉伸和放松在手柄的螺旋轴?…

Discussion

修改和故障排除中如何运用眼线改变样品的制备

选择克隆载体 。尽管此处描述的一般方案（ 图3），不需要特殊的克隆载体，该载体优选的是不具有固有的T7或T3启动子进行转录的便利性，使得启动子可通过PCR在所需的位置被引入。

序列和手柄的长度 。有没有具体的时序要求的手柄。然而，接近GC与AT比例是?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

Materials

Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D
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Keywords: Single RNA MoleculesOptical TweezersNanomanipulationRNA StructureRNA FoldingSingle-molecule ApproachesRNA Structural PolymorphismRNA HairpinsRNA Kissing ComplexTertiary StructureSecondary Structure
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Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. X. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).
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