Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.
İnsan genomunun büyük bir kısmı kopyalanmış fakat tercüme değildir. Bu Mesaja genomik çağda, RNA düzenleyici işlevleri giderek daha önemli olduğu gösterilmiştir. RNA işlevi çoğu zaman alternatif yapılarını benimsemek yeteneğine bağlıdır olarak, sırayla doğrudan RNA üç boyutlu yapılarını tahmin etmek zordur. Tek molekül bir seferde moleküler yapılarla bir molekül izleyerek RNA yapısal polimorfizmi sorunu çözmek için gösteri potansiyelleri yaklaşır. Bu çalışma, tam optik cımbız kullanarak tek RNA moleküllerinin, katlanma ve yapının manipüle etmek için bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, yöntemler tek moleküllü mekanik iş için uygun moleküller tanımlanmıştır sentezlenmesi için. Optik cımbız düzgün işlemleri sağlamak yanında, çeşitli kalibrasyon prosedürleri tartışılmıştır. Daha sonra, çeşitli deneyler açıklanmıştır. Tekniğin yararlılığını göstermek için, mekanik olarak saç tokası RNA açılımı sonuçlarını ve bir tek RNA öpmeyeceğing karmaşık delil olarak kullanılır. Bu örneklerde, bağımsız bir şekilde nanomanipulation tekniği, ikinci ve üçüncü dahil olmak üzere her yapısal etki katlanmasını incelemek için kullanılmıştır. Son olarak, sınırlamalar ve yöntemin gelecekteki uygulamalar tartışılmaktadır.
Optik cımbız tekniğinin gelişmesi uzun biyolojik araştırma uygulaması ile eşlik etti. Optik yakalama etkisi ilk keşfedildiği zaman, Arthur Aşkın kirli suda bakteri lazer odak 1 sıkışan olamayacağı görülmektedir. O zamandan beri, bakteri biyofizik öğrenci nesiller için bir kasıtsız, eğlenceli deney yanı sıra mikrobiyal fizyoloji 2,3 incelemek için ciddi bir araştırma aracı haline gelmiştir hapsi. Optik yakalama tekniği mikroskobik 1 nesne hareketsiz hale getirmek için odaklanmış bir lazer ışını kullanır. Pratik olarak, aynı zamanda, tutucu (koyup Dx) merkezinden yer değiştirmesi tarafından tuzağa nesne üzerinde bir kuvvet (F) ölçen bir optik yayı gibi bir lazer tuzak çalışır. Κ kısa bir aralıkta, F = κ x Dx, içindeki tuzak yay sabittir. Optik tuzak MICROS için picoNewton (PN), kesinlik kuvvet uygulamak için kullanılabilirCopic nesne ve nanometre (nm) doğrulukla konumunu ölçmek. Son yirmi yılda, optik cımbız biyofizik en çok kullanılan tek-molekül tekniklerinden biri haline gelmiştir. Tekniği katlama ve DNA 4-6, RNA 7-9 ve proteinlerin 10,11 mekaniğini incelemek için istihdam edilmiştir. Optik cımbız da DNA replikasyonunu 12 RNA transkripsiyonu 13, 14,15 ve protein sentezi, hem de diğer birçok biyomoleküler bir etkinlik 16-18 gözlemlemek için kullanılmıştır.
Tek molekül yaklaşımlar esas RNA engebeli katlama enerji manzara keşfetmek için RNA yapısal araştırma istihdam edilmektedir. Bir RNA dizisi nedeniyle genellikle RNA basit kimyasal bileşimi ve baz soyma kurallarına, birden fazla istikrarlı, birbirini dışlayan yapılar içine kat edebilirsiniz. Uzun RNA yapısal polimorfizm, bu riboswitches 19,20 meydana gelir, örneğin, gen regülasyonunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bir recent genom anket birkaç derece büyük ölçüde hücresel transcriptome 21 büyük bir kısmının yapısı ve protein sentezini etkileyen kadar küçük ki sıcaklık değişimlerini ortaya koymuştur. Bu örnek, daha önce tahmin edilenden daha alternatif RNA katlama biyolojik rolü belki de daha önemli ve yaygın olduğunu ipuçları. Yapısal polimorfizm, ancak birçok moleküllerinin ortalama özelliklerini incelemek geleneksel biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar için bir sorun teşkil etmektedir. Örneğin, "üzerinde" bir riboswitch bir "kapalı" konformasyonlar bağdaşmıyor. Heterojen bir yapı elde edilen bir ortalama yapısı biyolojik ilgili şekillerin ya da benzer olası değildir. Ayrıca, çevrilmemiş RNA ve mRNA genellikle yapılar oluştururlar. Proteinler ve düzenleyici RNA'lar ile etkileşimi yaygın etkileşimin bir parçası olarak mevcut yapının açığa çıkmasını gerektirir. Bu nedenle, RNA açılma / yeniden katlanmasını okuyan bir ilgili olurRNA biyoloji sorunu. Böyle bir sorun karşılamak için, tek-molekül yaklaşımı bir anda 22-27 az bir molekül okuyan RNA yapısal polimorfizmini çözülmeye istihdam edilmiştir.
Popüler tek molekül fluoresans yöntemiyle karşılaştırıldığında, açılma mekanik göre cımbız tek tek moleküller konformasyonları uygulanan kuvveti ile manipüle edilebilir ve nanometre hassasiyetle ölçülebilir bir avantaj sağlar. Bu özellik, büyük nanomanipulation RNA hiyerarşik katlama 28 kesilmiş olabilir, bireysel yapısal alanın açılma / katlanır izlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bir tek elyaf birçok konformerlerin birine katlanmasına yönelik olabilir; veya mevcut yapıya mekanik olarak farklı bir konformasyona 29 içine yeniden kapatmak için indüklenebilir. Biyolojik şartlar altında, bir RNA yapısı sıcaklık değişimi veya ligand bağlanması üzerine değiştirilebilir. Doğrudan manipüle moleküler s yeteneğikırılmalardan RNA yapısal çalışmanın yeni bir mekan açılıyor. Prensip olarak, böyle bir atomik kuvvet mikroskopu ve manyetik cımbızlar gibi diğer mekanik teknikler de, tek RNA moleküllerinin katlanmasını incelemek için kullanılabilir. Ancak bu gibi uygulamalar, nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü 30 büyük ölçüde sınırlıdır.
Optik cımbız iş RNA yapılarının mekanik güç ile katlanmamış sağlar.
Açılımı mekanik avantajı birkaç yönlüdür. Metal iyonları ve ligand uyarılmış katlama ağırlıklı üçüncül yapıları ile sınırlıdır, oysa Kuvvet, ikincil ve üçüncül yapıların her ikisinin de açılmak için kullanılabilir. Sıcaklık ve denatüran önemli ölçüde su ve çözünenlerin faaliyetlerini etkileyebilir. Buna karşılık, kuvvet moleküler yapılarını perturb lokal olarak uygulanır; çevresini üzerine uygulanan kuvvet etkisi ihmal edilebilir düzeydedir. Buna ek olarak, termal erime en küçük RNA yapılarını katlama termodinamik çalışma için kullanılır,optik cımbız yedi temel-çift tetraloop firkete 28 ikinci bir 400-nükleotid ribozim 31 kadar farklı boyutlarda RNA yapılarının incelenmesi için kullanılmıştır gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, RNA yapıları mekanik mezofilik sıcaklıklarda açılabilirler. Buna karşılık, bir termal erime deneyde RNA açılmak için, sıcaklık tipik olarak daha da önemli olarak, özellikle Mg +2 iyonlarının mevcudiyetinde, RNA, hidroliz artar fizyolojik sıcaklıklarda, üzerinde yükseltilir.
Bu kuvvet, bir mekanik etki yapısına tatbik edilir nasıl bağlı olduğunu not etmek önemlidir. Uygulanan kuvvet katlanan enerji manzara tenteli. Örneğin, saç tokası, bir kuvvet uygulandığında, baz çiftleri, sırasıyla, bir zaman (Şekil 1a) bir tane kırılır. Kopyalama çatal uygulanan kuvvete dik helezon ekseni boyunca ilerler. En az bir öpüşme karmaşık bir gerilim altında Bunun tersine, iki öpüşmeUygulanan kuvvet paralel olan baz çifti, bir güç yük paylaşımı (Şekil 1b). İkincil ve üçüncül katlama 28,32 ayırt etmek için kullanılabilir bunların farklı mekanik karşılık olarak uygulanan kuvvet sonucu firketenin ve öpüşme karmaşık ilişkide tutulur, dolayısıyla farklı geometriler. Açılımı mekanik teorik yönü önceden 8,9,30 gözden geçirilmiştir. Bu çalışma kurmak ve bir tek molekül mekanik açılımı analizini gerçekleştirmek için temel yaklaşımları özetliyor.
Deneysel Kurulumu. Bizim mekanik çekme deneyinde, tweezing için RNA numunesi iki çift bükümlü DNA / RNA kolları tarafından sınırlanan, ilgi konusu RNA (Şekil 2) oluşur 7. Tüm molekül sırasıyla streptavidin- biotin ve digoksijenin anti-digoksijenin antikor etkileşimleri, üzerinden iki yüzey kaplı mikron boyutunda boncuk (Spherotech) gergin olabilir. Bir boncuk bir kuvvet ölçme optik tr tarafından düzenlenenAP, diğer ise, bir mikropipet ucunda tutulur. Halkalar arasında göreceli mesafe tutucu direksiyon veya mikropipet ile hareket ya da değiştirilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, tek bir alana sıkıştırılmış boncuklar RNA molekülü gerilip serbest edilebilir.
Numune hazırlanması. Tweezing için RNA örneklerinin sentezi birkaç adımları içerir (Şekil 3) içerir. İlk olarak ilgili RNA'ya karşılık gelen DNA sekansı ilk olarak plazmid vektörüne klonlanır. Daha sonra, üç PCR reaksiyonu, iki kolları ve transkripsiyon için bir şablon üretmek için kullanılmaktadır. Transkripsiyon şablon sap bölümleri ve eklenen dizileri de kapsamına almaktadır. Tam uzunlukta RNA, in vitro transkripsiyon kullanılarak sentezlenir. Son olarak, RNA ve kimyasal olarak modifiye edilmiş kolları tweezing için molekülleri oluşturmak için bir araya tavlanır.
Kalibrasyon ve Cımbızlar Operasyonu. Minitweezers kullanımının temel tasarımBu çalışmada d ki çift-ışın optik cımbız 33 izler. İlk nesil optik cımbız ile karşılaştırıldığında pek iyileştirmelerle, Minitweezers olağanüstü dengeye sahiptirler. Birkaç ülkede araştırma grubu bir tek-molekül araştırmalarına 14,15,34-37 olarak Minitweezers kullanın. Talimat videolar dahil olmak üzere cihazın, inşaat, kalibrasyon ve operasyon bilgilerini, "Cımbız Lab" sitesinde (http://tweezerslab.unipr.it) mevcuttur. Burada, günlük bazda yapılması gereken iyileştirmeler ve kalibrasyon işlemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Tweezing Örnekleri Hazırlanmasında Modifikasyonu ve Sorun Giderme
Klonlama Vektör seçimi. Burada tarif edilen genel şema (Şekil 3), özel bir klonlama vektörü gerektirmese de, vektör, bir promotör istenilen pozisyonlarda durmasıyla PCR yoluyla dahil edilebilir şekilde transkripsiyonun kolaylığı için içsel T7 veya T3 için tercih edilmemektedir.
Dizi ve Kolları Uzunlukları. Kolları içi…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.
Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
Labview programming software | National Instruments | ||
NI Vision Builder | National Instruments | ||
Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |