Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

חלק גדול מהגנום האנושי הוא עיבד אבל לא תורגם. בעידן הגנומי הודעה זו, פונקציות רגולטוריות של RNA הוכחו להיות חשוב יותר ויותר. כפונקציה RNA תלויה לעתים קרובות ביכולתה לאמץ מבנים חלופיים, שקשה לחזות מבנים תלת ממדיים RNA ישירות מרצף. מולקולה בודדת גישות פוטנציאלי מופע כדי לפתור את הבעיה של פולימורפיזם מבני RNA על ידי ניטור מבנים מולקולריים מולקולה אחת בכל פעם. עבודה זו מציגה שיטה כדי לתפעל את הקיפול ומבנה של מולקולות RNA בודדות באמצעות פינצטה אופטית בדיוק. ראשית, שיטות לסנתז מולקולות מתאימות לעבודה מכאנית מולקולה בודדת מתוארות. הנהלים הבא, שונים כיול כדי להבטיח את פעילותו התקינה של פינצטה האופטית הם דנו. בשלב הבא, ניסויים שונים מוסברים. כדי להדגים את התועלת של הטכניקה, קיסין תוצאות של סיכות ראש RNA מכאני התגלגלות וRNA בודדמורכב גרם משמשים כראיה. בדוגמאות אלה, טכניקת nanomanipulation שימשה ללמוד קיפול של כל תחום מבני, ובכלל זה משני ושלישוני, באופן עצמאי. לבסוף, המגבלות ויישומים עתידיים של השיטה הם דנו.

Introduction

הפיתוח של טכניקת פינצטה האופטית כבר מלווה ארוך עם היישום שלה במחקר ביולוגי. כאשר השפעת ההשמנה האופטית התגלתה לראשונה, ארתור Ashkin ציין כי חיידקים במים מזוהמים יכולים להיות לכוד במוקד הלייזר ^1. מאז, חיידקי השמנה הפכו ניסוי לא מכוון, כיף לדורות של תלמידי ביופיסיקה, כמו גם כלי מחקר רציניים ללמוד פיזיולוגיה של חיידקים ^2,3. טכניקת הלכידה האופטית משתמשת בקרן לייזר ממוקדת כדי לשתק אובייקט מיקרוסקופי ^1. למעשה, פונקציות מלכודת לייזר כמעיין אופטי, אשר מודד גם כוח (F) על האובייקט שנלכד על ידי עקירתה ממרכז המלכודת (ΔX). בטווח קצר, F = κ x ΔX, בκ הוא קבוע הקפיץ של המלכודת. המלכודת האופטית יכולה לשמש כדי להפעיל כוח בpicoNewton דיוק (PN) למייקרואובייקט copic ולמדוד את עמדתה עם ננומטר דיוק (ננומטר). בשני העשורים האחרונים, פינצטה אופטית הפכה לאחד טכניקות מולקולה בודדת הנפוצות ביותר בביופיזיקה. הטכניקה כבר מועסק ללמוד מתקפל ומכניקה של DNA ^{4-6, 7-9} RNA, וחלבוני ^10,11. פינצטה אופטית יש גם שימשה להתבונן שכפול הדנ"א ^12, שעתוק RNA ^13, וסינתזה של חלבון ^14,15, כמו גם אירועים אחרים רבים biomolecular ^16-18.

גישות מולקולה בודדת מועסקות במחקר מבני RNA בעיקר כדי לחקור את נוף אנרגיית קיפול המחוספס של רנ"א. רצף הרנ"א בדרך כלל יכול לקפל לתוך מבנים יציבים, שוללות מרובים, בשל כללי הרכב כימי וקילוף בסיס הפשוט של רנ"א. זה כבר זמן רב ידוע כי פולימורפיזם מבני RNA, כגון שמתרחש בriboswitches ^19,20, ממלא תפקיד חשוב בויסות הגנים. Recenסקר הגנום t גילה כי שינויים בטמפרטורה קטנה כמו כמה מעלות להשפיע סינתזת מבנה וחלבון של חלק גדול מtranscriptome הסלולרי ²¹ מאוד. דוגמא זו מרמזת כי התפקיד הביולוגי של קיפול RNA החלופי הוא אולי יותר חשוב ונרחב יותר מאשר הניח בעבר. פולימורפיזם מבני, לעומת זאת, מהווה אתגר לגישות ביוכימיות וbiophysical המסורתיים, הבודקות תכונות ממוצעת של מולקולות רבות. לדוגמא, "על" ותצורות "את" של riboswitch אינן יכולות להתקיים. מבנה ממוצע נגזר ממבנים הטרוגנית אינו צפוי להיות דומה גם של conformers הרלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, RNA מתורגם וmRNA בדרך כלל ליצור מבנים. האינטראקציה שלהם עם חלבונים וRNAs הרגולציה נפוצה דורשת התגלגלות של מבנה הקיים, כחלק מהאינטראקציה. לכן, לומד RNA התגלגלות / refolding הופך רלוונטינושא של הביולוגיה RNA. כדי לעמוד באתגר כזה, גישת המולקולה בודדת כבר מועסק לפענח פולימורפיזם מבני RNA על ידי לימוד מולקולה אחת בכל פעם ^22-27.

בהשוואה לשיטת הקרינה המולקולה בודדת הפופולרית, פינצטה מבוססת מכאני התגלגלות מציעה יתרון כי תצורות של מולקולות בודדות ניתן להשפיע על ידי כוח ליישם ולמדוד בדייקנות ננומטר. יכולת nanomanipulation זה יכול להיות מנוצל כדי לפקח על התגלגלות / הקיפול של תחומים מבניים אדם כזה שמתקפל ההיררכי של RNA גדול יכול להיות גזור ^28. לחלופין, גדיל בודד יכול להיות מופנה אל לקפל לתוך אחד מכמה conformers; או מבנה הקיים יכול להיגרם באופן מכאני ללקפל לתוך קונפורמציה שונה ^29. בתנאים ביולוגיים, מבנה RNA ניתן לשנות על שינוי הטמפרטורה או ליגנד מחייב. היכולת של ים מולקולרי ישירות מניפולציהtructure פותח מקום חדש של מחקר המבני RNA. באופן עקרוני, טכניקות מכאניות אחרות, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי ופינצטה המגנטית, יכולות לשמש גם כדי ללמוד קיפול של מולקולות RNA בודדות. עם זאת, יישומים אמורים מוגבלים בעיקר בשל הרזולוציה מרחבית הנמוכה יחסית ^30.

העסקתו של פינצטה אופטית מאפשרת מבני RNA שפרשו בכוח מכאני.

היתרון של מכאני התגלגלות הוא פי כמה וכמה. כוח יכול לשמש כדי להתפתח מבנים הן משניים ושיישונים, ואילו יונים של מתכות ומתקפלים ליגנד המושרה הם בעיקר מוגבלים למבנים שלישוני. טמפרטורה וdenaturant יכולים להשפיע באופן משמעותי את פעילותם של מים ומומסים. בניגוד לכך, כוח מיושם באופן מקומי כדי להפריע מבנים מולקולריים; ההשפעה של כוח על הסביבה היא זניחה. בנוסף, היתוך תרמי משמש הטוב ביותר ללמוד תרמודינמיקה קיפול של מבני RNA קטנים,ואילו פינצטה אופטית הייתה בשימוש ללמוד מבני RNA בגדלים שונים, הנע בין סיכת ראש tetraloop שבעה בסיס זוג ²⁸ לribozyme 400 נוקלאוטיד ^{31 ב.} יתר על כן, מבני RNA ניתן פרשו באופן מכאני בטמפרטורות מזופיליות. בניגוד לכך, להתפתח RNAs בניסוי היתוך תרמי, הטמפרטורה עולה בדרך כלל הרבה מעל טמפרטורות פיסיולוגיות, אשר מגדילה באופן משמעותי הידרוליזה RNA, במיוחד בנוכחות של יוני Mg ^{2 +.}

חשוב לציין כי ההשפעה המכנית של כוח תלויה איך הוא מוחל למבנה. הכח ליישם מטה נוף האנרגיה מתקפל. לדוגמא, כאשר הכוח מוחל על סיכת ראש, זוגות בסיסיהם ברצף שבורים, אחד בכל פעם (איור 1 א). המזלג קורע מתקדם לאורך ציר הסליל, שהוא ניצב לכח ליישם. בניגוד לכך, כאשר מורכב נשיקות מינימליות הוא תחת מתח, שתי נשיקותזוגות בסיסים, אשר מקבילים לכח המונע, חולקים את כוח העומס (איור 1b). הגיאומטריות השונות של סיכת הראש ויחסית מורכבים לנשק לתוצאת הכוח ליישם בתגובה המכנית השונות שלהם, שיכול להיות מנוצל כדי להבחין קיפול שניוני ושלישונית ^28,32. ההיבט התיאורטי של מכאני התגלגלות נבדק בעבר ^8,9,30. עבודה זו מתארת ​​את הגישות הבסיסיות להקמה ולבצע assay התגלגלות מכאני מולקולה בודדת.

התקנה ניסיונית. ⁷ בניסוי מושך המכני שלנו, מדגם RNA לtweezing מורכב מרנ"א של עניין וצדיו שתי ידיות פעמיים תקועים DNA / RNA (איור 2). כל המולקולה יכולה להיות קשורה לשני חרוזים מצופים משטח בגודל מיקרון (Spherotech) באמצעות streptavidin ביוטין ואינטראקציות נוגדן digoxigenin-אנטי digoxigenin, בהתאמה. חרוז אחד מוחזק על ידי TR האופטי למדידת כוחap, ואילו האחרים מוחזק על קצה micropipette. המרחק היחסי בין חרוזים ניתן לשנות על ידי מי מנווט את המלכודת או העברת micropipette. שימוש בגישה זו, מולקולת RNA חד קשירת חרוזים יכולה להיות מתוחה ורגועה.

הכנת דוגמאות. הסינתזה של דגימות RNA לtweezing כוללת כמה צעדים (איור 3). ראשית, רצף DNA המתאים לRNA של עניין הוא משובט ראשון בוקטור פלסמיד. בשלב בא, שלוש תגובות PCR מבוצעות כדי ליצור שתי ידיות ותבנית לשעתוק. תבנית השעתוק מקיפה את אזורי הידית ורצפים שהוכנסו. RNA באורך המלא הוא מסונתז על ידי שעתוק במבחנה. אחרון, RNA וידיות שינוי כימי הם מרותקים יחד כדי ליצור מולקולות למריטות חוזרות ונשנה.

כיול והפעלה של מלקחיים. העיצוב הבסיסי של שימוש Minitweezersד בעבודה זו נובע כי בפינצטה האופטית כפול קורה ^33. עם שיפורים רבים, Minitweezers להציג יציבות יוצאת דופן בהשוואה לפינצטה האופטית הדור הראשון. מספר קבוצות מחקר בכמה מדינות להשתמש Minitweezers במחקר המולקולה בודדת שלהם ^14,15,34-37. הפרטים של בנייה, כיול, והפעלה של המכשיר, כוללים קטעי וידאו הדרכה, זמינים באתר האינטרנט של "המעבדה מלקטת" (http://tweezerslab.unipr.it). הנה, שיפורים ונהלי כיול שצריך להתבצע על בסיס יומי מתוארים בפירוט.

Protocol

.1 הכנת RNA המולקולות לtweezing מולקולה בודדת שיבוט הרצף של עניין. לשכפל את רצף DNA התואם את מבנה RNA לוקטור. סינתזה וטיהור של תבנית השעתוק. לסנתז תבנית שעתוק על ידי PCR. [שולחן מקום 1 כאן] הבא, לטהר מוצרי …

Representative Results

מוגבלת על ידי מרחב, nanomanipulation של מולקולות RNA יחידה באה לידי ביטוי בהצגת דוגמאות רק מכאניות התגלגלות של סיכות ראש RNA וRNA עם מבנה שלישוני. מניפולציות מולקולות בודדת מכבנה ברגע שרצועה שנו…

Discussion

שינוי ופתרון בעיות בהכנת דוגמאות tweezing

בחירה של שיבוט וקטור. על אף שהתכנית הכללית שתוארה כאן (איור 3) אינה דורש וקטור שיבוט מיוחד, הווקטור הוא העדיף שלא צריך T7 הפנימי או אמרגן T3 עבור קלות השעתוק כזה שאמרגן …

Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D