Ratiometrisk bimolekylære beacons (RBMBs) kan anvendes til at afbilde enkelt manipuleret RNA-transkripter i levende celler. Her beskriver vi forberedelse og rensning af RBMBs, levering af RBMBs i celler ved mikroporering og fluorescerende billeddannelse af enkelt RNA-transkripter i real-tid.
Den voksende erkendelse af, at både den tidsmæssige og rumlige regulering af genekspression kan have betydelige konsekvenser for cellefunktion har ført til udviklingen af forskellige teknikker til at visualisere de enkelte RNA-transkripter i enkelte levende celler. En lovende teknik, der for nylig blevet beskrevet benytter en oligonucleotid-baseret optisk sonde, ratiometrisk bimolekylær beacon (RBMB), til påvisning af RNA-transkripter, der var manipuleret til at indeholde mindst fire tandemgentagelser af RBMB målsekvensen i 3'-utranslaterede region. RBMBs er specielt konstrueret til at udsende en lys fluorescerende signal ved hybridisering til komplementært RNA, men ellers forbliver standset. Anvendelsen af en syntetisk probe i denne fremgangsmåde giver fotostabile, rød-skiftede og stærkt emitterende organiske farvestoffer, der skal anvendes til billeddannelse. Binding af flere RBMBs til de konstruerede RNA-transkripter resulterer i diskrete fluorescenspletter når de ses under et bredt felt fluorescerende mikroskop. Derfor kan bevægelsen af individuelle RNA-transkripter let visualiseres i realtid ved at tage en serie af fluorescerende billeder tid. Her beskriver vi fremstilling og oprensning af RBMBs, levering i celler ved mikroporering og leve-cell imaging af enkelte RNA-transkripter.
Udtrykket og regulering af RNA-transkripter er en kompleks og dynamisk proces, der er i høj grad ansvarlig for at kontrollere celle adfærd og skæbne. Selvom betydningen af RNA i diktere cellefunktion har været kendt i nogen tid, er det ofte vanskeligt at drage klare forbindelser mellem de to, da de fleste RNA-analyseværktøjer mangler den rumlige og tidsmæssige opløsning kræves for at optage vigtige regulerende begivenheder såsom transskription brister, RNA menneskehandel, og lokaliserede RNA-behandling. Dette har ført til fremkomsten af flere teknikker, der tillader individuelle RNA-transkripter, der skal visualiseres i levende celler i realtid 1. Måske den mest fremtrædende af disse teknikker anvender et GFP-MS2-fusionsproteinet til at målrette RNA, der er blevet manipuleret til at indeholde tandemgentagelser af MS2-bindingssted i 3'-UTR 2,3. Ved at bringe flere GFP-molekyler i tæt nærhed, individuelle RNA-transkripter fremstå som lyse fluorescerende plettervia fluorescensmikroskopi. GFP-MS2-system har givet en hidtil uset indsigt i RNA adfærd, herunder direkte visualisering og målinger af transkriptionelle sprængfyldt 4,5, påvisning af unikke sub-cellulære lokalisering og behandling 6-9, og real-time scanning af RNA-transport 10. Trods det enorme potentiale af GFP-MS2 system kan ubundne GFP-MS2-fusionsproteiner skabe en høj baggrund fluorescerende signal, der begrænser alsidigheden og dynamikområde af denne teknik. Adskillige fremgangsmåder er blevet udviklet til at begrænse denne baggrund signal, herunder subcellulære opdeling af ubundet GFP-MS2 10 proteinfragment komplementation 11, og alternative RNA-bindende proteiner og mål 12. Men alle disse fremgangsmåder forbliver følsomme over for den relative og totale ekspression af RNA-mål og GFP-MS2 fusionsprotein.
Som etlternative til GFP-MS2-systemer, har molekylære beacons også blevet anvendt til at påvise manipuleret RNA-transkripter med tandemgentagelser af den komplementære bindingssted i 3'-UTR 13,14. Molecular beacons er hårnåle-dannende oligonukleotidprober, der er mærket i den ene ende med en quencher og ved den anden ende med et fluorescerende reporter. Når den ikke er forpligtet til at målrette RNA den fluorescerende reporter og quencher forblive i umiddelbar nærhed, hvilket resulterer i en lav-fluorescerende tilstand. Efter hybridisering den fluorescerende reporter og quencheren tvunget fra hinanden og fluorescens er genoprettet. Svarende til GFP-MS2-system, binding af flere molekylære beacons på en enkelt RNA-transkript resulterer i en stærkt fluorescerende plet, der kan identificeres ved hjælp af fluorescens mikroskopi; imidlertid er baggrundsfluorescens forventes at være meget lavere på grund af den bratkølede konfigurationen af ubundne molekylære beacons. Til trods den smarte aktiveringsmekanisme, der er indeholdt i deolecular beacon design, er der nu voksende beviser for, at ikke-hybridiseret molekylære beacons ikke forbliver i hårnål kropsbygning når det indføres i levende celler. Derfor er de genererer et falsk positivt signal, der reducerer signal-til-baggrund. For at overvinde denne mangel, vi for nylig udviklet et nyt syntetisk sonde til billeddannelse RNA i levende celler Ratiometrisk bimolekylære beacons (RBMBs; figur 1a) 15,16. RBMBs er sammensat af to 2'-O-methyl-oligonukleotid strenge, der danner en hybrid struktur med egenskaber fra både korte hårnål RNA (shRNA) og molekylære beacons. Sløjfen og fluorescensaktivering mekanisme svarer til den molekylære beacon, mens den lange dobbeltstrenget domæne med en 3'-UU overhæng er mere karakteristisk for shRNA. De shRNA funktioner er designet til at køre nuklear eksport, som vi har fundet stigninger intracellulær levetid til> 24 timer, med minimal observerbare nedbrydning, oghindrer uspecifik åbning af sløjfen. Som et resultat RBMBs udviser en signifikant højere signal-baggrund end molekylære beacons.
Det skal bemærkes, at RBMBs ikke kan fremstilles ved hjælp af DNA-oligonukleotider, da DNA-baserede prober ikke besidder de samme kernevåbenkapacitet eksport som RNA-baserede prober. Strukturelt er RBMB løkke typisk designet til at være mellem 15 og 21 baser lange, for at skabe en balance mellem specificitet og selektivitet ved RNA hybridisering. Den korte stilk, der udgør de to selvstændige komplementære domæner er normalt designet til at være 4 baser. Hvis der vælges en længere stilk, er hastigheden af hybridisering mellem RBMB loop og mål-RNA betydeligt langsommere 17,18. Omvendt, når en kortere stamceller sekvens er valgt smeltetemperaturen ofte er for lav til at opretholde stilk-loop-struktur ved 37 ° C, hvilket fører til en høj baggrund signal. Specificiteten af RBMB er også røduced som stilken længde forkortes. Da sekvensen af RBMB stilk-sløjfe kan også påvirke RBMB præstationer, skal udvælges omhyggeligt 19. Især bør ideelle loop sekvenser har minimal sekundær struktur, hybridisere til RNA-sekvenser med minimal sekundær struktur, undgå proteinbindingssteder og undgå off-target-bindende. Forudsigelser af både RBMB og RNA sekundær struktur kan opnås ved hjælp af software som f.eks mfold 20. Supplerende off-target sites kan identificeres ved hjælp af et nukleotid Basic Local Assignment søgeværktøj (BLAST). Men på grund af uoverensstemmelser i modellens forudsigelser og det er vanskeligt at identificere protein-biding websteder, specificitet alle RBMBs sidste ende skal valideres eksperimentelt.
Om ønsket kan en uquenchet henvisning farvestof, der er ufølsom over for hybridisering tilstand sættes til RBMB 15. Tilføjelsen af en reference farvestof kan PRovide en markør for sonde levering og bruges til ratiometrisk billeddannelse, hvis der kræves mere nøjagtige målinger af totale cellulære fluorescens. Referenceværdierne farvestoffer tillader målinger, der skal justeres for forskelle i baggrunden på grund af celle-til-celle variation i leveringen. Men når billeddannelse individuelle RNA-transkripter, reference farvestof er ikke nødvendig. Især kan nogle reference farvestoffer interferere med eksport af RBMBs fra kernen, hvilket fører til en lidt højere baggrund signal i kernen.
Når konstrueret korrekt, kan RBMBs anvendes til at afbilde individuelle RNA-transkripter i enkelte levende celler, hvis målet RNA manipuleret til at indeholde mindst fire RBMB bindingssteder (figur 1B) 16. RBMBs effektivt kan leveres i en lang række af celletyper via mikroperforering, med lidt eller ingen virkning på cellelevedygtighed 21, og kvantitative målinger af genekspression kan væreerhvervet inden for 30 min. Desuden metode er forholdsvis ufølsom over for RBMB koncentration og mål-RNA-niveauer, eftersom fluorescens fra ubundne RBMBs effektivt er standset. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den anvendte metode til at forberede og rense RBMBs, samt en generel procedure for levering af RBMBs ind i levende celler via mikroporering og billeddannelse af enkelt RNA-transkripter i real-tid.
Evnen til at afbilde enkelt manipuleret RNA-transkripter i levende celler ved hjælp af en konventionel lang-felt mikroskop kræver en lys og fotostabile fluorescerende signal at være forbundet med hver RNA transcript og en lav fluorescerende baggrund stammer fra ubundne fluorescerende prober. Ved denne fremgangsmåde er en lys fluorescerende signal opnået ved hybridisering flere (op til 96) oligonukleotid-baserede fluorescerende prober, dvs RBMBs, på hver RNA-transkript. Men så få som fire bindinger stede…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation KARRIERE Award (0953583) og National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
SOLA light engine | Lumencor | ||
Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |