הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי
Summary
משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.
Abstract
ההבנה הגוברת ששתי הרגולציה של הזמן ומרחב של ביטוי גנים יכולה להיות השלכות חשובות על תפקוד תאים הובילה לפיתוחן של טכניקות מגוונות לדמיין תעתיקי רנ"א פרט בתאי חיים בודדים. טכניקה מבטיחה אחת לאחרונה כי תוארה מנצלת בדיקה מבוססת oligonucleotide אופטי, ratiometric משואת bimolecular (RBMB), כדי לזהות מולקולות RNA שהונדסו כדי להכיל לפחות ארבעה חוזרים טנדם של רצף יעד RBMB באזור 3'-מתורגם. RBMBs נועד במיוחד כדי לפלוט אות ניאון בוהקת על הכלאה לRNA המשלים, אבל חוץ מזה נשאר הרווה. השימוש בבדיקה סינתטית בגישה זו מאפשרת photostable, אדום העביר, וצבעים אורגניים emissive מאוד לשמש הדמיה. כריכה של RBMBs מרובה לתוצאות תעתיקי רנ"א המהונדסים במקומות דיסקרטיים הקרינה כאשר מתחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב בתחום. כתוצאה מכך, התנועה של מולקולות RNA בודדות יכולה להיות דמיין בקלות בזמן אמת על ידי לקיחת סדרת זמן של תמונות ניאון. כאן אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, משלוח לתאים על ידי microporation ולחיות תאי הדמיה של מולקולות RNA בודדות.
Introduction
הביטוי והרגולציה של מולקולות RNA הוא תהליך מורכב ודינמי שהוא אחראי במידה רבה לשליטה בהתנהגות תא וגורל. למרות חשיבותו של RNA בתפקוד תא מכתיב כבר ידועה לכמה זמן, הוא לעתים קרובות קשה לצייר קשרים ברורים בין השניים שכן רוב כלי ניתוח RNA חסרי הרזולוציה המרחב ובזמן הנדרשת כדי ללכוד אירועי רגולציה חשובים כגון התפוצצות שעתוק, RNA סחר, ועיבוד RNA מקומי. זה הוביל להופעתו של מספר טכניקות שתאפשרנה תעתיקי רנ"א בודדים להיות דמיינו בתאים חיים בזמן אמת 1. אולי, הבולט ביותר של טכניקות אלה מנצל חלבון היתוך GFP-MS2 למקד RNA שתוכנן כדי להכיל חוזר טנדם של האתר מחייב MS2 ב3'-UTR 2,3. על ידי הבאת מולקולות GFP מרובות לתוך סמיכות, תעתיקי רנ"א בודדים מופיעים כתמים בהירים כמו ניאוןבאמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מערכת GFP-MS2 סיפקה תובנה חסרת תקדים לתוך RNA התנהגות, כוללים הדמיה ישירה ומדידות של תעתיק מתפוצצת 4,5, זיהוי של לוקליזציה משנה הסלולר ייחודית ועיבוד 6-9, והדמיה של רנ"א תחבורה 10 בזמן אמת. עם זאת, למרות הפוטנציאל העצום של מערכת GFP-MS2, חלבוני היתוך GFP-MS2 מאוגדים יכולים ליצור אות ניאון גבוה רקע שמגבילה את הגמישות וטווח דינמי של טכניקה זו. מספר גישות פותחו כדי להגביל את אות רקע זה, לרבות מידור subcellular של GFP-MS2 מאוגד 10, שלמת בר חלבון 11, וחלבוני RNA מחייב חלופיים ומטרות 12. עם זאת, כל הגישות הללו יישארו רגישים לביטוי היחסי ומוחלט של יעד RNA וחלבון היתוך GFP-MS2.
כlternative למערכות GFP-MS2, משואות מולקולריות יש גם משמשות לאיתור תעתיקי רנ"א מהונדס עם חוזר טנדם של האתר הקישור משלים ב3'-UTR 13,14. משואות מולקולריות הן בדיקות oligonucleotide יוצרי סיכת ראש שמסומנות בקצה אחד עם מרווה ובקצה השני עם כתב ניאון. כאשר אינו מחויבים למקד RNA כתב הניאון ומרווה להישאר בסמיכות, וכתוצאה מכך מדינה נמוכה ניאון. על הכלאה, הכתב ומרווית הניאון נאלצים לגזרים והקרינה משוחזרת. בדומה למערכת GFP-MS2, את הכריכה של משואות מולקולריות מרובות על תוצאות תעתיקי הרנ"א יחידים במיקום ניאון בהיר שיכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי; עם זאת, הקרינה הרקע צפויה להיות נמוכים בהרבה, בשל התצורה הרווה של משואות מולקולריות מאוגדים. למרבה הצער, למרות מנגנון ההפעלה המתוחכם שהוא שולב מ 'עיצוב משואת olecular, עכשיו יש ראיות הולכות ומצטברות כי unhybridized משואות מולקולריות לא נשאר בקונפורמציה סיכת הראש בעת שהוכנס לתאים חיים. כתוצאה מכך, הם מייצרים אות חיובית שגויה שמפחיתה את האות לרקע באופן משמעותי. כדי להתגבר על חסרון זה, לאחרונה פיתח בדיקה סינתטית חדשה לRNA הדמיה בתאים חיים, משואות bimolecular ratiometric (RBMBs; איור 1 א) 15,16. RBMBs מורכב משני גדילי oligonucleotide 2'-O-מתיל היוצרים מבנה היברידי עם תכונות משני RNA הקצר סיכת הראש (shRNA) ומשואות מולקולריות. מנגנון הלולאה והפעלת הקרינה דומה למגדלור המולקולרי, ואילו תחום פעמיים התקועות הארוך עם הסככה 3'-UU הוא יותר אופייני לshRNA. תכונות shRNA נועדו להסיע את היצוא גרעיני, שבו אנו מוצאים עליות חיים תאיים ל> 24 שעות, עם השפלה נצפית מינימאלית, ומונע פתיחה הלא ספציפית של הלולאה. כתוצאת RBMBs תערוכת רקע אות לגבוה יותר באופן משמעותי ממשואות מולקולריות.
יש לציין כי RBMBs לא יכול להיות מוכן באמצעות oligonucleotides DNA, מאז בדיקות מבוססות DNA לא להחזיק את אותן יכולות יצוא גרעיניות כמו בדיקות מבוססות RNA. מבחינה מבנית, RBMB הלולאה נועדה בדרך כלל להיות בין 15 ו21 בסיסים ארוכים, כדי ליצור איזון בין הספציפיות וסלקטיביות על הכלאת RNA. הגבעול הקצר שיוצר מהתחומים שני עצמי משלים בדרך כלל נועד להיות 4 בסיסים. אם גזע כבר נבחר, השיעור של הכלאה בין לולאת RBMB וRNA היעד מואט באופן משמעותי 17,18. לעומת זאת, כאשר רצף גזע קצר יותר נבחר טמפרטורת ההתכה היא לעתים קרובות נמוכה מדי כדי לקיים את מבנה גזע הלולאה על 37 מעלות צלזיוס, מה שמוביל לאות רקע גבוהה. את הספציפיות של RBMB היא גם אדומותuced כאורך הגזע מתקצר. מאז הרצף של גזע הלולאה RBMB גם יכול להשפיע על תפקוד RBMB, זה חייב להיות שנבחר בקפידה 19. בפרט, צריכים להיות רצפי לולאה אידיאליים מבנה המשני מינימאלי, להכליא רצפי הרנ"א עם מבנה משני מינימאלי, להימנע מאתרי קישור של חלבון, ולהימנע מחוץ יעד מחייב. ניתן להשיג את תחזיות של שני RBMB ומבנה משני RNA באמצעות תוכנה כגון mfold 20. משלימים אתרים מחוץ היעד יכולים זוהו באמצעות כלי נוקלאוטיד יסוד מקומי חיפוש הקצאה (תפציץ). עם זאת, בשל חוסר עקביות בתחזיות מודל ואת הקושי בזיהוי אתרי מכבדי חלבון, את הספציפיות של כל RBMBs חייבות סופו של דבר להיות מאומתות בניסוי.
אם רצוי, צבע התייחסות unquenched שאינו רגיש למדינת ההכלאה ניתן להוסיף לRBMB 15. התוספת של צבע התייחסות יכולה יחסי הציבורovide סמן למסירת בדיקה ולשמש הדמיה ratiometric, אם מדידות מדויקות יותר של הקרינה סלולרית בסך הכל נדרשות. צבעי ההתייחסות מאפשר מדידות להיות מותאמות להבדלים ברקע בשל וריאציות תא אל התא במשלוח. עם זאת, כאשר ההדמיה RNA הבודד תמלילי צבע ההתייחסות הוא לא הכרחי. יש לציין, צבעים מסוימים התייחסות יכולים להפריע ליצוא של RBMBs מהגרעין, שהוביל לאות רקע מעט גבוהה יותר בגרעין.
כאשר מתוכנן כראוי, יכול לשמש RBMBs לתעתיקי רנ"א הבודד תמונה בתאי חיים בודדים, אם RNA היעד מתוכנן להכיל לפחות ארבעה אתרי RBMB מחייבים (איור 1 ב) 16. RBMBs יכול להיות מועבר בצורה יעילה למגוון רחב של סוגי תאים באמצעות microporation, עם לא מעט השפעה על תא כדאיות 21, ומדידות כמותיות של ביטוי גנים יכולות להיותרכש בתוך 30 דקות. יתר על כן, המתודולוגיה היא די רגישה לרמות ריכוז RBMB וRNA היעד, שכן הקרינה מRBMBs מאוגד הוא הרווה ביעילות. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של המתודולוגיה המשמשת להכנה ולטהר RBMBs, כמו גם נוהל כללי לאספקת RBMBs לחית תאים באמצעות microporation וההדמיה של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
יכולת תמלילים יחידים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי דורשת אות ניאון בהירה וphotostable להיות מזוהה עם כל תעתיקי הרנ"א ורקע ניאון נמוך הנובע מבדיקות ניאון מאוגדים. בשיטה זו, אות ניאון בהירה מושגת על ידי הכלאה מרובה (עד 96) בדיקות ניאון מב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על קרן מדע קריירת הפרס הלאומי (0953583) והמכון הלאומי לבריאות NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 על ידי.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
References
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
