비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상
Summary
비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.
Abstract
두 유전자 발현의 시공간적 규제 세포 기능에 중요한 영향을 미칠 수 성장 실현 단일 살아있는 세포에서 개별 RNA 전 사체를 시각화하기 위해 다양한 기술이 개발되었다. 최근에 설명 된 한가지 유망한 기술은 3'-비 번역 영역 RBMB 표적 서열의 적어도 네 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었다 RNA 전 사체를 검출 올리고 뉴클레오타이드 기반의 광학 탐침, 비율 적 이분자 비컨 (RBMB)를 이용한다. RBMBs 구체적으로 보완 RNA에 혼성화에 따라 밝은 형광 신호를 방출하도록 설계되어 있지만, 그렇지 않으면 침묵 상태로 유지됩니다. 이 방법에서는 프로브의 합성 사용 적색 편이, 광 안정성 허용하고, 높은 발광 유기 염료는 촬상을 위해 사용된다. 넓은 필드 형광 현미경으로 볼 때 개별 형광 명소의 설계 RNA 전 사체 결과에 여러 RBMBs의 결합. 결과적으로, 각각의 RNA 전 사체의 이동이 용이 형광 화상의 시계열을 촬영하여 실시간으로 시각화 될 수있다. 여기에서 우리는 microporation에 의해 세포로 제조 및 정제 RBMBs의 배달을 설명하고 살고 셀 단일 RNA 전 사체의 이미지를.
Introduction
RNA 전 사체의 발현 및 조절은 세포의 행동과 운명을 제어하기위한 주로 담당하는 복잡하고 역동적 인 과정이다. 지시 된 세포 기능의 RNA의 중요성이 얼마 동안 알려져 있지만,이 가장 RNA 분석 도구는 전사 붕괴 중요 규제 이벤트를 캡처하기 위해 필요한 공간 및 시간 해상도가 부족하기 때문에, RNA 들간의 연결을 그리는 힘들다 인신 매매 및 지역화 된 RNA 처리. 이것은 각각의 RNA 전 사체가 실시간 1에 살아있는 세포에 시각화 할 수 있도록 여러 기술의 출현하게되었다. 아마,이 기술의 가장 눈에 띄는는 3'-UTR 2,3에 MS2 결합 부위의 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었습니다 RNA를 대상으로 GFP-MS2 융합 단백질을 이용한다. 가까운 거리에 여러 GFP 분자를 제공함으로써, 각각의 RNA 전 사체는 밝은 형광 점으로 나타나는형광 현미경을 통한. GFP-MS2 시스템은 직접 시각화 및 전사의 측정 4,5 분출 독특한 서브 셀룰러 지역화 및 처리 6-9의 검출, 및 RNA 수송층 (10)의 실시간 영상을 포함한 RNA 동작으로 전례 통찰력을 제공하고있다. 그러나, GFP-MS2 시스템의 엄청난 잠재력에도 불구하고, 언 바운드 GFP-MS2 융합 단백질이 기술의 다양성과 동적 범위를 제한하는 높은 배경 형광 신호를 생성 할 수 있습니다. 몇몇 접근법은 세포 내 비 결합 GFP-MS2 (10)의 구획화, 단백질 단편 상보성 (11), 및 대체 RNA 결합 단백질을 포함하여, 이러한 배경 신호를 제한하기 위해 개발 및 12을 표적으로되었다. 그러나 이러한 접근 방법은 모든 RNA 표적과 MS2-GFP 융합 단백질의 상대적 총 발현에 민감한 남아있다.
로GFP-MS2 시스템에 lternative, 분자 비콘은 3'-UTR 13,14에 상보적인 결합 부위의 탠덤 반복으로 조작 된 RNA 전 사체를 검출하기 위해 사용되어왔다. 분자 비콘은 소광 한 끝에 형광 리포터와 함께 타단 개는 헤어핀 – 형성 올리고 뉴클레오티드 프로브이다. 소광 RNA에게 형광 기자를 대상으로 바인딩하지 않을 경우 낮은 형광 상태의 결과로, 가까이에 남아있다. 하이브리드시, 형광 기자와 소광 떨어져 강제로 형광이 복원됩니다. GFP-MS2 시스템, 형광 현미경으로 식별 할 수있는 밝은 형광 반점의 단일 RNA 전 사체의 결과로 여러 분자 표지의 결합에 유사; 그러나, 배경 형광 인해 비 결합 분자 비컨 켄칭 구성으로, 훨씬 낮은 것으로 예상된다. 불행하게도, 영리 활성화 메커니즘에도 불구하고 그 m에 통합olecular 표지 디자인, 살아있는 세포에 도입 할 때 머리 핀의 자형 형태를 유지하지 않는 분자 비콘을 unhybridized 성장 증거가 지금있다. 결과적으로, 그들은 훨씬 신호대 배경을 감소 위양성 신호를 생성한다. 15, 16,이 단점을 극복하기 위해, 우리는 최근 살아있는 세포, 비율 계량 생체 분자 비콘 (그림 1A RBMBs)에 영상 RNA에 대한 새로운 합성 프로브를 개발했다. RBMBs 짧은 헤어핀 RNA (shRNA를) 및 분자 비콘 모두의 기능을 가진 복합 구조체를 형성하는 두 개의 2'-O-메틸 가닥 올리고 뉴클레오티드로 구성된다. 3'-오버행과 UU 긴 이중 가닥 도메인 shRNA를 더 특징 인 반면 루프 및 형광 활성화 메커니즘, 분자 비콘 유사하다. shRNA를 기능은 최소한의 관찰 저하 우리는> 24 시간으로 증가에게 세포 수명을 발견 핵 수출을 구동하도록 설계되어루프의 비 특정 개방을 방지 할 수 있습니다. 결과 RBMBs 분자 비콘보다 훨씬 높은 신호 대 배경을 나타내고있다.
RBMBs가 RNA 기반 프로브와 같은 핵 수출 기능을 소유하지 않은 DNA 프로브 기반하기 때문에, DNA 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 제조 할 수 없다는 것을 또한 주목해야한다. 구조적 RBMB 루프는 일반적으로 RNA 혼성화시 특이성 및 선택성 사이의 균형을 만들기 위해, 길이 (15) 및베이스 (21) 사이에있을 수 있도록 설계된다. 이 자체 보완 도메인에서 형성하는 짧은 줄기는 보통 4 기지가 될 수 있도록 설계되었습니다. 이상 줄기가 선택된 경우 RBMB 루프와 표적 RNA와 혼성화 속도는 상당히 17,18 둔화된다. 줄기 짧은 시퀀스가 선택되면 반대로, 용융 온도가 높은 백그라운드 신호 선도, 37 ° C에서 스템 – 루프 구조를 유지하기 위해 종종 너무 낮다. RBMB의 특이성은 빨간색입니다줄기 길이를 짧게 같이 uced. 또한 RBMB 성능에 영향을 미칠 수 RBMB 스템 – 루프의 서열 때문에, 조심스럽게 19을 선택한다. 특히, 이상적인 루프 서열은, 최소한의 이차 구조를 가져야 최소한 이차 구조와 RNA 서열에 혼성화, 단백질 결합 부위를 방지하고, 바인딩 표적 이탈 방지. RBMB 및 RNA 이차 구조 모두의 예측은 mfold (20)와 같은 소프트웨어를 사용하여 얻을 수있다. 보완 오프 대상 사이트는 염기 기본 지역 지정 검색 도구 (BLAST)를 사용하여 식별 할 수 있습니다. 그러나, 모델 예측과 단백질 기다리고 사이트를 식별하는 데 어려움 불일치의 모든 RBMBs의 특이도는 궁극적으로 실험적으로 검증되어야합니다.
바람직한 경우, 혼성화 상태에 민감하다 unquenched 기준 염료 RBMB (15)에 첨가 될 수있다. 기준 염료의 추가 홍보 할 수 있습니다프로브 배달 마커 ovide 총 형광 세포의보다 정확한 측정이 요구되는 경우, 비율 적 촬상에 사용될. 기준 염료 측정 배달 세포 간 차이로 인해 배경에서의 차이에 대해 조정될 수있다. 그러나, 개개의 RNA를 묘화 할 때 참조하면 염료가 필요하지 않다 사체. 특히, 일부 참조 염료는 핵에 약간 더 높은 배경 신호로 이어지는 핵에서 RBMBs의 수출을 방해 할 수 있습니다.
적절하게 설계하면 표적 RNA는 적어도 네 RBMB 결합 부위 (도 1b) (16)를 포함하도록 설계된다면, RBMBs는 단일 살아있는 세포에서 개별 이미지 RNA 전 사체에 사용될 수있다. RBMBs 효율적으로 세포 생존율 (21)에 아무런 영향이 거의, microporation 통해 세포 유형의 넓은 범위로 제공 될 수 있으며, 유전자 발현의 정량적 인 측정을 할 수있다30 분 이내에 취득했다. 바인드 RBMBs부터 형광을 효율적으로 급냉되기 때문에 더욱이, 방법은, RBMB 농도와 표적 RNA 수준에 비교적 둔감하다. 여기서 우리는 RBMBs을 제조하고 정제하는 데 사용되는 방법의 상세한 설명뿐만 아니라 microporation 통해 라이브 세포로 RBMBs의 전달을위한 일반 절차와 실시간 단일 RNA 전 사체의 화상을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기존의 넓은 필드 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체 할 수있는 능력은 각 RNA 전 사체 언 바운드 형광 프로브로부터 나오는 낮은 형광 배경에 관련 지을 수있는 밝고 광 안정성 형광 신호를 필요로한다. 이 방법에서, 밝은 형광 신호는 각각의 RNA 전 사체 상에, (96까지) 다중 올리고 뉴클레오티드 계 형광 프로브, 즉 RBMBs 혼성화함으로써 달성된다. 그러나, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (0953583) 및 건강 NCI / R21-CA116102의 국립 연구소, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766에 의해 지원되었다.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
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