Real-time Imaging av Enkelt Engineered RNA transkripsjoner i levende celler ved hjelp Proporsjonellekspansjon bimolekylære Beacons

Summary

Proporsjonal bimolecular beacons (RBMBs) kan brukes til bilde enkelt konstruert RNA transkripsjoner i levende celler. Her beskriver vi forberedelse og rensing av RBMBs, levering av RBMBs inn celler ved microporation og fluorescerende avbildning av enkelt RNA transkripsjoner i sanntid.

Abstract

Den voksende erkjennelse av at både tid og rom regulering av genuttrykk kan ha viktige konsekvenser på cellefunksjonen har ført til utvikling av ulike teknikker for å visualisere enkelte RNA transkripsjoner i én levende celler. En lovende teknikk som nylig har blitt beskrevet, anvender et oligonukleotid-basert optisk sonde, ratiometrisk bimolekylære radiofyr (RBMB), for å påvise RNA-transkripter som ble konstruert for å inneholde minst fire tandem repetisjoner av RBMB target-sekvensen i 3'-ikke-translaterte området. RBMBs er spesielt designet for å avgi en lys fluorescerende signal ved hybridisering til komplementær RNA, men ellers forblir slukket. Bruken av en syntetisk probe ved denne fremgangsmåten gjør det mulig photostable, rød-forskjøvet, og høyst emissive organiske fargestoffer som skal brukes for avbildning. Binding av flere RBMBs til de konstruerte RNA transkripsjoner resultater i diskrete fluorescens flekker sett under et bredt felt fluorescerende mikroskop. Følgelig kan bevegelse av individuelle RNA-transkripter blir lett visualisert i sanntid ved å ta et tidsserie av fluorescerende bilder. Her beskriver vi forberedelse og rensing av RBMBs, levering i cellene ved microporation og live-cell imaging av single RNA transkripsjoner.

Introduction

Uttrykket og regulering av RNA transkripsjoner er en kompleks og dynamisk prosess som er i stor grad ansvarlig for å kontrollere celle atferd og skjebne. Selv om betydningen av RNA i dikterer celle funksjon har vært kjent i noen tid, er det ofte vanskelig å trekke klare sammenhenger mellom de to siden de fleste RNA analyseverktøy mangler romlig og tidsmessig oppløsning kreves for å fange viktige regulatoriske hendelser som transkripsjon sprengning, RNA trafficking, og lokalisert RNA prosessering. Dette har ført til bruk av flere teknikker som gjør at enkelte RNA transkripsjoner å bli visualisert i levende celler i sanntid ^en. Kanskje den mest fremtredende av disse teknikkene utnytter en GFP-MS2 fusjonsprotein å målrette RNA som er konstruert for å inneholde tandem gjentakelser av MS2 bindingssetet i 3'-UTR ^2,3. Ved å bringe flere GFP molekyler i umiddelbar nærhet, synes enkelte RNA transkripsjoner som lyse fluorescerende flekkervia fluorescens mikroskopi. GFP-MS2 system har gitt enestående innsikt i RNA atferd, inkludert direkte visualisering og målinger av transcriptional sprengning ^4,5, påvisning av unike sub-cellulær lokalisering og behandling ^6-9, og sanntids avbildning av RNA transport ^10. Imidlertid, til tross for den enorme potensielle av GFP-MS2-system, kan ubundne GFP-MS2-fusjonsproteiner skape en høy bakgrunn fluorescerende signal som begrenser allsidighet og det dynamiske området for denne teknikken. Flere tilnærminger har blitt utviklet for å begrense denne bakgrunn signal, inkludert subcellulære compartmentalization av ubundet GFP-MS2 ^10, protein fragment complementation ^11, og alternative RNA bindende proteiner og mål ^12. Men alle disse metodene være følsom for den relative og total ekspresjon av RNA-target og GFP-MS2-fusjonsprotein.

Som enlternative til GFP-MS2 systemer, har molekylære beacons også blitt brukt til å oppdage konstruert RNA transkripsjoner med tandem gjentakelser av den komplementære bindingssetet i 3'-UTR ^13,14. Molekylære radiofyr er hårnål-dannende oligonukleotid-prober som er merket i den ene enden med en quencher, og ved den annen ende med et fluorescerende reporter. Når den ikke er bundet til target RNA den fluorescerende reporter og quencher forbli i tett nærhet, noe som resulterer i en lav-fluorescerende tilstand. Ved hybridisering, er den fluorescerende reporter og drikk tvunget fra hverandre og fluorescens er gjenopprettet. I likhet med GFP-MS2-system, bindingen av flere molekyl beacons på et enkelt RNA-transkripsjon resulterer i en lys fluorescerende flekk som kan identifiseres ved fluorescens mikroskopi; imidlertid er bakgrunnsfluorescens forventet å være mye lavere, på grunn av undertrykket konfigurasjonen av ubundne molekylære radiofyr. Dessverre finnes det, til tross for smart aktiveringsmekanisme som er innlemmet i molecular beacon design, er det nå økende bevis for at uhybridisert molekylære beacons ikke forbli i hårnål konformasjon når introdusert i levende celler. Følgelig, de genererer et falskt positivt signal som i betydelig grad reduserer signal-til-bakgrunn. For å overvinne denne brist, vi nylig utviklet en ny syntetisk probe for bildebehandling RNA i levende celler, Proporsjonellekspansjon bimolecular beacons (RBMBs; Figur 1a) ^15,16. RBMBs er sammensatt av to 2'-O-metyl-oligonukleotid-tråder som danner en hybrid struktur med trekk fra både korte hårnål RNA (shRNA) og molekyl signalene. Sløyfen og fluorescens aktiveringsmekanismen er lik den molekylære beacon, mens den lange dobbelt-trådet domene med et 3'-overheng UU er mer karakteristisk for shRNA. De shRNA funksjonene er utformet for å drive kjernefysisk eksport, som vi har funnet øker intracellulær levetid til> 24 timer, med minimal observer degradering, ogforhindrer ikke-spesifikk åpning av sløyfen. Som et resultat RBMBs utviser en betydelig høyere signal-til-bakgrunn enn molekylære beacons.

Det bør bemerkes at RBMBs ikke kan fremstilles ved hjelp av DNA-oligonukleotider, ettersom DNA-baserte prober ikke besitter de samme atom eksport muligheter som RNA-baserte prober. Strukturelt er den RBMB sløyfen typisk utformet til å være mellom 15 og 21 baser lange, for å skape en balanse mellom spesifisitet og selektivitet ved RNA hybridisering. Den korte stammen som danner fra de to selvkomplementære domener er vanligvis laget for å være fire baser. Hvis en lengre stem er valgt, er frekvensen av hybridisering mellom RBMB loop og målet RNA betydelig redusert ^17,18. Omvendt, når en kortere stammen sekvens er valgt smeltetemperaturen er ofte for lav til å opprettholde stammesløyfestrukturen ved 37 ° C, som fører til et høyt bakgrunnssignal. Spesifisiteten av RBMB er også røduced som stammen lengde forkortes. Siden sekvensen av RBMB stem-sløyfe kan også påvirke RBMB ytelse, må det nøye utvalgt ^19. Særlig bør ideelt sløyfe sekvenser ha minimal sekundær struktur, hybridisere til RNA-sekvenser med minimal sekundær struktur, unngå proteinbindingsseter, og unngå off-target-binding. Spådommer om både RBMB og RNA sekundærstruktur kan oppnås ved hjelp av programvare som mfold ^20. Komplementære off-target områder kan identifiseres ved hjelp av en nukleotid Basic Local Assignment Search Tool (BLAST). Men på grunn av uoverensstemmelser i modellprediksjoner og vanskeligheter med å identifisere protein avventende nettsider, spesifisitet av alle RBMBs må til slutt godkjennes eksperimentelt.

Hvis ønskelig, kan en unquenched referanse fargestoff som er ufølsom for hybridisering tilstand tilsettes til RBMB ^15.. Tillegg av en referanse fargestoff kan provide en markør for probe levering og brukes for ratiometrisk bildebehandling, hvis mer nøyaktige målinger av totalt celle fluorescens er påkrevd. Referansefargestoffer tillater målinger å bli justert for forskjeller i bakgrunnen på grunn av celle-til-celle-variasjoner i leveransen. Imidlertid, når avbildning individuelle RNA-transkripter referanse fargestoff er ikke nødvendig. Spesielt, kan noen referansefargestoffer interferere med utførsel av RBMBs fra kjernen, fører til en noe høyere bakgrunnssignalet i kjernen.

Når utformet på riktig måte, kan RBMBs brukes til bilde individuelle RNA-transkripter i enkelt levende celler, hvis target RNA er konstruert for å inneholde minst fire RBMB bindingsseter (Figur 1b) ^16. RBMBs effektivt kan leveres til et bredt spekter av celler typer via microporation, med liten eller ingen virkning på cellelevedyktighet ^21, og kvantitative målinger av genekspresjon kan blierverves i løpet av 30 min. Dessuten er metoden ganske ufølsom for RBMB konsentrasjon og target RNA-nivå, siden fluorescens fra ubundne RBMBs er effektivt undertrykket. Her vi gi en detaljert beskrivelse av metodene som er brukt til å forberede og rense RBMBs, samt en generell fremgangsmåte for levering av RBMBs inn i levende celler via microporation og avbildning av enkelt RNA-transkripter i sanntid.

Protocol

I denne protokollen, ble en oligonukleotid (RBMB1) merket på sitt 5'-enden med en CF640R reporter fargestoff og har sekvensen: 5'- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3 '. Selv utfyllende domener, som driver dannelsen av hårnål struktur, er i fet skrift. Det andre oligonukleotidet (RBMB2) ble merket i 3'-enden med en Iowa-Sp Sort RQ quencher og har sekvensen: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU m…

Representative Results

Kort tid etter at microporation av HT1080-celler i nærvær av RBMBs, til individuelle RNA-transkripter som ble konstruert inneholde flere RBMB bindingsseter i sin 3'-UTR vises som lyse fluorescerende flekker når avbildes med vid-feltet fluorescensmikroskopi (figur 2). Mens individuelle RNA-transkripter med så få som fire RBMB bindingsseter kan bli avbildet i levende celler, jo mer RBMB bindingsseter i det 3'-UTR, jo sterkere det fluorescerende signal. Dessuten, jo flere RBMBs som er bundet t…

Discussion

Evnen til å danne bilde enkle konstruerte RNA-transkripter i levende celler ved hjelp av en konvensjonell bred-feltet mikroskop krever en lys og photostable fluorescerende signal for å være assosiert med hvert RNA-transkript og en lav fluorescerende bakgrunns kommer fra ubundne fluorescerende prober. I denne metoden blir et fluorescent signal oppnådd ved hybridisering flere (opptil 96) av oligonukleotid-basert fluorescerende prober, dvs. RBMBs, på hver RNA-transkript. Men så få som fire bindinger nettste…

Materials

Nuclease-free Water	Life Technologies	AM9932	no DEPC-treated
DPBS	Life Technologies	14190-144	No Ca2+ and Mg2+
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	P290-500
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	P284-500
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	S381-500
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5mL
Chromatography Column	Kimble Chase Life Science	420400-0720	0.7x20cm
Superdex 75 Prep Grade	GE healthcare	17-1044-01
Syringe Pump	Braintree Scientific	BS-300
Syringe	BD	301035	60mL, Luer-lok tip
Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC501096	Mw 10,000 cutoff
Centrifuge 5418	Eppendorf
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG	lyophilized powder, g-irradiated
8-well chambered coverglass	Fisher Scientific	155409	Working volume 0.2-0.5mL
HT1080	ATCC	CCL-121	Human Fibrosarcoma cell line
Cell Culture Flask	Corning	430639	25cm2
DMEM	Life Technologies	11965084	High glucose
DMEM without Phenol Red	Life Technologies	21063029	High glucose
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
Penecillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122
Trypsin	Life Technologies	25300054	0.05% Trypsin-EDTA
Neon transfection system	Life Technologies	MPK5000
Neon transfection system kit	Life Technologies	MPK1096
Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-10
Hoescht 33342	Life Technologies	H1399
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus
SOLA light engine	Lumencor
Metamorph	Molecular Devices		Software controlling microscope
Immersol oil 518F	Fisher Scientific	12-624-66B