Proporsjonal bimolecular beacons (RBMBs) kan brukes til bilde enkelt konstruert RNA transkripsjoner i levende celler. Her beskriver vi forberedelse og rensing av RBMBs, levering av RBMBs inn celler ved microporation og fluorescerende avbildning av enkelt RNA transkripsjoner i sanntid.
Den voksende erkjennelse av at både tid og rom regulering av genuttrykk kan ha viktige konsekvenser på cellefunksjonen har ført til utvikling av ulike teknikker for å visualisere enkelte RNA transkripsjoner i én levende celler. En lovende teknikk som nylig har blitt beskrevet, anvender et oligonukleotid-basert optisk sonde, ratiometrisk bimolekylære radiofyr (RBMB), for å påvise RNA-transkripter som ble konstruert for å inneholde minst fire tandem repetisjoner av RBMB target-sekvensen i 3'-ikke-translaterte området. RBMBs er spesielt designet for å avgi en lys fluorescerende signal ved hybridisering til komplementær RNA, men ellers forblir slukket. Bruken av en syntetisk probe ved denne fremgangsmåten gjør det mulig photostable, rød-forskjøvet, og høyst emissive organiske fargestoffer som skal brukes for avbildning. Binding av flere RBMBs til de konstruerte RNA transkripsjoner resultater i diskrete fluorescens flekker sett under et bredt felt fluorescerende mikroskop. Følgelig kan bevegelse av individuelle RNA-transkripter blir lett visualisert i sanntid ved å ta et tidsserie av fluorescerende bilder. Her beskriver vi forberedelse og rensing av RBMBs, levering i cellene ved microporation og live-cell imaging av single RNA transkripsjoner.
Uttrykket og regulering av RNA transkripsjoner er en kompleks og dynamisk prosess som er i stor grad ansvarlig for å kontrollere celle atferd og skjebne. Selv om betydningen av RNA i dikterer celle funksjon har vært kjent i noen tid, er det ofte vanskelig å trekke klare sammenhenger mellom de to siden de fleste RNA analyseverktøy mangler romlig og tidsmessig oppløsning kreves for å fange viktige regulatoriske hendelser som transkripsjon sprengning, RNA trafficking, og lokalisert RNA prosessering. Dette har ført til bruk av flere teknikker som gjør at enkelte RNA transkripsjoner å bli visualisert i levende celler i sanntid en. Kanskje den mest fremtredende av disse teknikkene utnytter en GFP-MS2 fusjonsprotein å målrette RNA som er konstruert for å inneholde tandem gjentakelser av MS2 bindingssetet i 3'-UTR 2,3. Ved å bringe flere GFP molekyler i umiddelbar nærhet, synes enkelte RNA transkripsjoner som lyse fluorescerende flekkervia fluorescens mikroskopi. GFP-MS2 system har gitt enestående innsikt i RNA atferd, inkludert direkte visualisering og målinger av transcriptional sprengning 4,5, påvisning av unike sub-cellulær lokalisering og behandling 6-9, og sanntids avbildning av RNA transport 10. Imidlertid, til tross for den enorme potensielle av GFP-MS2-system, kan ubundne GFP-MS2-fusjonsproteiner skape en høy bakgrunn fluorescerende signal som begrenser allsidighet og det dynamiske området for denne teknikken. Flere tilnærminger har blitt utviklet for å begrense denne bakgrunn signal, inkludert subcellulære compartmentalization av ubundet GFP-MS2 10, protein fragment complementation 11, og alternative RNA bindende proteiner og mål 12. Men alle disse metodene være følsom for den relative og total ekspresjon av RNA-target og GFP-MS2-fusjonsprotein.
Som enlternative til GFP-MS2 systemer, har molekylære beacons også blitt brukt til å oppdage konstruert RNA transkripsjoner med tandem gjentakelser av den komplementære bindingssetet i 3'-UTR 13,14. Molekylære radiofyr er hårnål-dannende oligonukleotid-prober som er merket i den ene enden med en quencher, og ved den annen ende med et fluorescerende reporter. Når den ikke er bundet til target RNA den fluorescerende reporter og quencher forbli i tett nærhet, noe som resulterer i en lav-fluorescerende tilstand. Ved hybridisering, er den fluorescerende reporter og drikk tvunget fra hverandre og fluorescens er gjenopprettet. I likhet med GFP-MS2-system, bindingen av flere molekyl beacons på et enkelt RNA-transkripsjon resulterer i en lys fluorescerende flekk som kan identifiseres ved fluorescens mikroskopi; imidlertid er bakgrunnsfluorescens forventet å være mye lavere, på grunn av undertrykket konfigurasjonen av ubundne molekylære radiofyr. Dessverre finnes det, til tross for smart aktiveringsmekanisme som er innlemmet i molecular beacon design, er det nå økende bevis for at uhybridisert molekylære beacons ikke forbli i hårnål konformasjon når introdusert i levende celler. Følgelig, de genererer et falskt positivt signal som i betydelig grad reduserer signal-til-bakgrunn. For å overvinne denne brist, vi nylig utviklet en ny syntetisk probe for bildebehandling RNA i levende celler, Proporsjonellekspansjon bimolecular beacons (RBMBs; Figur 1a) 15,16. RBMBs er sammensatt av to 2'-O-metyl-oligonukleotid-tråder som danner en hybrid struktur med trekk fra både korte hårnål RNA (shRNA) og molekyl signalene. Sløyfen og fluorescens aktiveringsmekanismen er lik den molekylære beacon, mens den lange dobbelt-trådet domene med et 3'-overheng UU er mer karakteristisk for shRNA. De shRNA funksjonene er utformet for å drive kjernefysisk eksport, som vi har funnet øker intracellulær levetid til> 24 timer, med minimal observer degradering, ogforhindrer ikke-spesifikk åpning av sløyfen. Som et resultat RBMBs utviser en betydelig høyere signal-til-bakgrunn enn molekylære beacons.
Det bør bemerkes at RBMBs ikke kan fremstilles ved hjelp av DNA-oligonukleotider, ettersom DNA-baserte prober ikke besitter de samme atom eksport muligheter som RNA-baserte prober. Strukturelt er den RBMB sløyfen typisk utformet til å være mellom 15 og 21 baser lange, for å skape en balanse mellom spesifisitet og selektivitet ved RNA hybridisering. Den korte stammen som danner fra de to selvkomplementære domener er vanligvis laget for å være fire baser. Hvis en lengre stem er valgt, er frekvensen av hybridisering mellom RBMB loop og målet RNA betydelig redusert 17,18. Omvendt, når en kortere stammen sekvens er valgt smeltetemperaturen er ofte for lav til å opprettholde stammesløyfestrukturen ved 37 ° C, som fører til et høyt bakgrunnssignal. Spesifisiteten av RBMB er også røduced som stammen lengde forkortes. Siden sekvensen av RBMB stem-sløyfe kan også påvirke RBMB ytelse, må det nøye utvalgt 19. Særlig bør ideelt sløyfe sekvenser ha minimal sekundær struktur, hybridisere til RNA-sekvenser med minimal sekundær struktur, unngå proteinbindingsseter, og unngå off-target-binding. Spådommer om både RBMB og RNA sekundærstruktur kan oppnås ved hjelp av programvare som mfold 20. Komplementære off-target områder kan identifiseres ved hjelp av en nukleotid Basic Local Assignment Search Tool (BLAST). Men på grunn av uoverensstemmelser i modellprediksjoner og vanskeligheter med å identifisere protein avventende nettsider, spesifisitet av alle RBMBs må til slutt godkjennes eksperimentelt.
Hvis ønskelig, kan en unquenched referanse fargestoff som er ufølsom for hybridisering tilstand tilsettes til RBMB 15.. Tillegg av en referanse fargestoff kan provide en markør for probe levering og brukes for ratiometrisk bildebehandling, hvis mer nøyaktige målinger av totalt celle fluorescens er påkrevd. Referansefargestoffer tillater målinger å bli justert for forskjeller i bakgrunnen på grunn av celle-til-celle-variasjoner i leveransen. Imidlertid, når avbildning individuelle RNA-transkripter referanse fargestoff er ikke nødvendig. Spesielt, kan noen referansefargestoffer interferere med utførsel av RBMBs fra kjernen, fører til en noe høyere bakgrunnssignalet i kjernen.
Når utformet på riktig måte, kan RBMBs brukes til bilde individuelle RNA-transkripter i enkelt levende celler, hvis target RNA er konstruert for å inneholde minst fire RBMB bindingsseter (Figur 1b) 16. RBMBs effektivt kan leveres til et bredt spekter av celler typer via microporation, med liten eller ingen virkning på cellelevedyktighet 21, og kvantitative målinger av genekspresjon kan blierverves i løpet av 30 min. Dessuten er metoden ganske ufølsom for RBMB konsentrasjon og target RNA-nivå, siden fluorescens fra ubundne RBMBs er effektivt undertrykket. Her vi gi en detaljert beskrivelse av metodene som er brukt til å forberede og rense RBMBs, samt en generell fremgangsmåte for levering av RBMBs inn i levende celler via microporation og avbildning av enkelt RNA-transkripter i sanntid.
Evnen til å danne bilde enkle konstruerte RNA-transkripter i levende celler ved hjelp av en konvensjonell bred-feltet mikroskop krever en lys og photostable fluorescerende signal for å være assosiert med hvert RNA-transkript og en lav fluorescerende bakgrunns kommer fra ubundne fluorescerende prober. I denne metoden blir et fluorescent signal oppnådd ved hybridisering flere (opptil 96) av oligonukleotid-basert fluorescerende prober, dvs. RBMBs, på hver RNA-transkript. Men så få som fire bindinger nettste…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation KARRIERE Award (0953583) og National Institute of Health NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
SOLA light engine | Lumencor | ||
Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |